Channelrhodopsin

Channelrhodopsin
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	Channelrhodopsin
Bezeichner
Gen-Name(n)	ChR1, ChR2, VChR1
Transporter-Klassifikation
TCDB	3.E.1.7
Bezeichnung	ionenverschiebendes mikrobielles Rhodopsin
Vorkommen
Übergeordnetes Taxon	Algen

Channelrhodopsine (deutsch auch: Kanalrhodopsine) sind Ionenkanäle, die in der Zellmembran bestimmter einzelliger Algen vorkommen. Blaues Licht führt zur Öffnung dieser Kanäle (engl. light-gated) und zum Einstrom von Ionen in die Zelle. Durch Channelrhodopsine wird das Membranpotential und die Ionenkonzentration im Cytosol von der Lichtintensität abhängig. Wird ein Gen für Channelrhodopsin in Nervenzellen eingeschleust, kann die elektrische Erregbarkeit dieser Nervenzellen durch Lichtpulse kontrolliert werden (Optogenetik).

Die ersten Channelrhodopsine, die entdeckt wurden, Channelrhodopsin-1 (ChR1) und Channelrhodopsin-2 (ChR2), dienen Grünalgen der Gattung Chlamydomonas als sensorische Photorezeptoren.<ref></ref> Sie leiten positiv geladenen Ionen (Kationen) in die Zelle und steuern damit negative und positive phototaxische Reaktionen bei hohem Lichteinfall. VChR1 wurde in der vielzelligen Alge Volvox gefunden; sein Absorptionsmaximum liegt bei einer höheren Wellenlänge als ChR1 und ChR2. Es zeigt aber eine Übereinstimmung der Aminosäuresequenz von 80 % zur ChR1-Gruppe, wodurch diese Proteine als homolog zueinander betrachtet werden.<ref name="ZhangPriggeDeisseroth2008">Vorlage:Cite book/URL Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung2</ref> Neben diesen kationen-leitenden Channelrhodopsinen wurden in cryptophyten Algen Channelrhodopsine gefunden, die negativ geladene Ionen (Anionen) leiten.<ref></ref> Werden anionenleitende Channelrhodopsine (engl. ACR) in Nervenzellen eingeschleust, können diese Nervenzellen durch Beleuchtung an der Aktivierung gehindert werden (engl. silencing).

Aufbau und Funktion

Channelrhodopsine (ChR) sind, wie andere Rhodopsine auch, Proteine mit sieben helikalen Transmembrandomänen und einem Retinal-Chromophor, der als protonierte Schiffsche Base kovalent an das Protein gebunden ist. Das Absorptionsmaximum von ChR2 liegt mit ungefähr 460–470 nm im Blauen. Sobald das all-trans-Retinal im Protein-Retinal-Komplex Licht absorbiert, isomerisiert es zu einem 13-cis-Retinal und verursacht dadurch eine Konformationsänderung des Proteins. Diese führt zum Öffnen der Pore im Protein, ihr Durchmesser beträgt mindestens 0,6 nm. Das 13-cis-Retinal relaxiert nach einiger Zeit zurück zum all-trans-Retinal, wodurch sich die Pore wieder schließt und der Ionenfluss unterbrochen wird.<ref name="PNAS">Vorlage:Cite book/URL Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung2</ref> Während die meisten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (darunter Rhodopsin) Ionenkanäle indirekt mittels sekundärer Botenstoffe öffnen, bildet bei den Channelrhodopsinen das Protein selbst eine Pore. Dieser Aufbau ermöglicht eine sehr schnelle und zuverlässige Depolarisation der Zelle. Bei heterologer Expression von ChR2 in Nervenzellen kann durch einen kurzen Lichtpuls (1–2 ms) ein Aktionspotential ausgelöst werden. In den meisten Zelltypen ist hinreichend Retinal (Vitamin A) vorhanden, um die Produktion funktionsfähiger Channelrhodopsine ohne Zusatz von Retinal zu ermöglichen.

Varianten für die Anwendung in optogentischen Experimenten

Der Austausch von Aminosäuren nahe der retinalen Bindungstasche (Punktmutation) beeinflusst die biophysikalischen Eigenschaften von Channelrhodopsin. Verschiedene Arbeitsgruppen haben durch gezielte Mutationen eine Vielzahl von optogenetischen Werkzeugen generiert.

Kinetik

Im Allgemeinen sind Gruppen von Channelrhodopsinen mit langsamer Kinetik lichtempfindlicher, da sich offene Kanäle im Laufe der Zeit auch bei niedrigen Lichtpegeln akkumulieren. Das Schließen eines Kanals nach der optischen Aktivierung kann durch Mutation der Proteinreste C128 oder D156 wesentlich verzögert werden. Diese Modifikation führt zu hochempfindlichen Channelrhodopsinen, die durch einen blauen Lichtimpuls geöffnet und durch einen grünen oder gelben Lichtimpuls geschlossen werden können (Step-function opsins).<ref></ref> Die Mutation des E123-Restes beschleunigt die Kanalkinetik, und die resultierenden ChR2-Mutanten (ChETA) wurden verwendet, um Neuronen mit bis zu 200 Hz feuern zu lassen.<ref></ref>

Photostrom-Amplitude

H134R- und T159C-Mutanten zeigen erhöhte Photoströme; eine Kombination von T159 und E123 (ET/TC) hat etwas größere Photoströme und eine etwas schnellere Kinetik als Wildtyp-ChR2.<ref></ref> Unter ChR-Varianten zeigt ChIEF, eine Chimäre und Punktmutante von ChR1 und ChR2, die größten Photoströme und die geringste Desensibilisierung und besitzt eine Kinetik, die ChR2 ähnelt.<ref></ref>

Anregungswellenlänge

Chimäre Channelrhodopsine wurden durch Kombination von Transmembran-Helices aus ChR1 und VChR1 entwickelt, was zu ChRs mit roten Spektralverschiebungen führte (z. B. C1V1, ReaChR).<ref></ref> ReaChR kann in Säugetierzellen mit sehr hoher Dichte in die Zellmembran eingebaut werden und wurde für die minimalinvasive, transkranielle Aktivierung von Hirnstamm-Motoneuronen eingesetzt. Die Suche nach homologen Sequenzen in anderen Organismen führte zu spektral verbesserten und stärker rotverschobenen Channelrhodopsinen (z. B. ChrimsonR).<ref></ref> In Kombination mit ChR2 ermöglichen diese gelb- / rotlichtempfindlichen Channelrhodopsine die Kontrolle von zwei Populationen von Neuronen unabhängig voneinander mit Lichtpulsen unterschiedlicher Farben. Ein blauverschobenes Channelrhodopsin wurde in der Alge Scherffelia dubia entdeckt. Nach einigen Mutationen zur Verbesserung des Membrantransports und der Geschwindigkeit führte das resultierende Werkzeug (CheRiff) zu großen Photoströmen bei Anregung durch blaues Licht (460 nm)<ref>Daniel R. Hochbaum, Yongxin Zhao, Samouil L. Farhi, Nathan Klapoetke, Christopher A. Werley, Vikrant Kapoor, Peng Zou, Joel M. Kralj, Dougal Maclaurin, Niklas Smedemark-Margulies, Jessica L. Saulnier, Gabriella L. Boulting, Christoph Straub, Yong Ku Cho, Michael Melkonian, Gane Ka-Shu Wong, D. Jed Harrison, Venkatesh N. Murthy, Bernardo L. Sabatini, Edward S. Boyden, Robert E. Campbell, Adam E. Cohen: All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. In: Nature Methods. Band 11, Nr. 8, August 2014, S. 825–833, doi:10.1038/nmeth.3000, PMID 24952910, PMC 4117813 (freier Volltext). </ref>.

Ionenselektivität

Die meisten Channelrhodopsine sind unspezifische Kationenkanäle. Werden sie in Neuronen exprimiert, leiten sie überwiegend Na⁺-Ionen und wirken daher depolarisierend (erregend). Es wurden Varianten mit hoher Kalziumdurchlässigkeit entwickelt (CatCh<ref></ref>, CapChR1<ref></ref>), die ebenfalls erregend wirken. Zur Hemmung neuronaler Aktivität durch Hyperpolarisation wurden zunächst bakterielle Chlorid-Pumpen (Halorhodopsin) verwendet, die allerdings anhaltend hohe Lichtintensitäten benötigen.<ref>Feng Zhang, Li-Ping Wang, Martin Brauner, Jana F. Liewald, Kenneth Kay, Natalie Watzke, Phillip G. Wood, Ernst Bamberg, Georg Nagel, Alexander Gottschalk, Karl Deisseroth: Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. In: Nature. Band 446, Nr. 7136, April 2007, S. 633–639, doi:10.1038/nature05744. </ref> 2014 gelang es, den Kationenkanal ChR2 in einen Anionenkanal mit hoher Leitfähigkeit für Chlorid-Ionen zu verwandeln.<ref></ref><ref></ref> Kurz darauf wurden natürliche Chlorid-Channelrhodopsine mit hoher Leitfähigkeit entdeckt (GtAChR)<ref>Elena G. Govorunova, Oleg A. Sineshchekov, Roger Janz, Xiaoqin Liu, John L. Spudich: Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. In: Science. Band 349, Nr. 6248, 7. August 2015, S. 647–650, doi:10.1126/science.aaa7484, PMID 26113638, PMC 4764398 (freier Volltext). </ref>. Noch stärker hyperpolarisierend wirken kaliumselektive Channelrhodopsine (KCRs, WiChR), die 2022 in verschiedenen Protisten entdeckt wurden.<ref>Johannes Vierock, Enrico Peter, Christiane Grimm, Andrey Rozenberg, I-Wen Chen, Linda Tillert, Alejandro G. Castro Scalise, Marilù Casini, Sandra Augustin, Dimitrii Tanese, Benoît C. Forget, Rémi Peyronnet, Franziska Schneider-Warme, Valentina Emiliani, Oded Béjà, Peter Hegemann: WiChR, a highly potassium-selective channelrhodopsin for low-light one- and two-photon inhibition of excitable cells. In: Science Advances. Band 8, Nr. 49, 9. Dezember 2022, doi:10.1126/sciadv.add7729, PMID 36383037, PMC 9733931 (freier Volltext). </ref> Werden kalium- oder chloridselektive Channelrhodopsine in Neuronen exprimiert, hyperpolarisieren sie die Zellmembran bei Beleuchtung und verhindern so die Entstehung von Aktionspotenzialen (hemmende Wirkung). Kombinations-Konstrukte von hemmenden und erregenden Channelrhodopsinen ermöglichen die vollständige Kontrolle neuronaler Aktivität durch die Farbe (Wellenlänge) der Beleuchtung.<ref>Johannes Vierock, Silvia Rodriguez-Rozada, Alexander Dieter, Florian Pieper, Ruth Sims, Federico Tenedini, Amelie C. F. Bergs, Imane Bendifallah, Fangmin Zhou, Nadja Zeitzschel, Joachim Ahlbeck, Sandra Augustin, Kathrin Sauter, Eirini Papagiakoumou, Alexander Gottschalk, Peter Soba, Valentina Emiliani, Andreas K. Engel, Peter Hegemann, J. Simon Wiegert: BiPOLES is an optogenetic tool developed for bidirectional dual-color control of neurons. In: Nature Communications. Band 12, Nr. 1, 26. Juli 2021, doi:10.1038/s41467-021-24759-5. </ref>

Anwendungen in der Forschung

Datei:ChR2scheme.png

Schematische Darstellung eines ChR2-RFP-Fusionsproteins. RFP ist ein rot fluoreszierendes Protein, das ähnlich wie GFP zur Markierung von Zellstrukturen eingesetzt werden kann.

Während der N-Terminus die sieben Transmembrandomänen einschließt, reicht das C-terminale Ende des ChR2-Proteins in den Intrazellularraum hinein und kann ersetzt oder verändert werden, ohne dass die Funktion des Proteins als Ionenkanal beeinträchtigt wird. Channelrhodopsine können mit einer Reihe von Transfektionstechniken (virale Transfektion, Elektroporation, Genkanone) in erregbaren Zellen wie Neuronen exprimiert (produziert) werden. Vitamin-A, die Vorstufe des lichtabsorbierenden Chromophors Retinal ist in Wirbeltier-Zellen meist schon vorhanden, so dass sich erregbare Zellen, die ein Channelrhodopsin exprimieren, durch Beleuchtung einfach depolarisieren lassen.

Aufgrund dieser Eigenschaften interessieren sich Biotechnik und Neurowissenschaften für den Einsatz von Channelrhodopsinen, beispielsweise für Anwendungen wie die Photostimulation von Neuronen. Das blauempfindliche ChR2 in Kombination mit der durch Gelblicht-aktiviertierbaren Chloridpumpe Halorhodopsin erlauben das An- und Abschalten der neuronalen Aktivität innerhalb von Millisekunden.<ref name="ZhangDeisseroth2007">Vorlage:Cite book/URL Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung2</ref> Das Fachgebiet, das sich mit der Kontrolle von genetisch modifizierten Zellen mittels Licht beschäftigt, wird als Optogenetik bezeichnet.

Die Sehfunktion blinder Mäuse konnte durch Expression von ChR2 in Bipolarzellen der Netzhaut im Auge teilweise wiederhergestellt werden.<ref name="Roska2008">Vorlage:Cite book/URL Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung2</ref> Vorstellbar ist auch eine zukünftige medizinische Verwendung von ChR2 bei bestimmten Formen der retinalen Degeneration oder zur Stimulation tief liegender Gehirnabschnitte.

Inzwischen wurden im Rahmen der pflanzlichen Optogenetikforschung sowohl ChR2, als auch ACR, erfolgreich in Modellpflanzen etabliert<ref name=":0"></ref><ref></ref><ref></ref>. Dies bietet völlig neue Möglichkeiten pflanzliche Signaltransduktionsprozesse zu untersuchen. Durch die Etablierung von ChR2 in Arabidopsis thaliana wurde es z. B. möglich, neue Erkenntnisse im Bereich der Erzeugung elektrischer Signale in Pflanzen zu erzielen<ref name=":0" />.

Einzelnachweise

Literatur

Vorlage:Cite book/URL Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung2 (Einsatz Channelrhodopsin in transgenen Mäusen zur Erforschung der neuronalen Verschaltung im Gehirn)
Vorlage:Cite book/URL Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung Vorlage:Cite book/Meldung2 (Channelrhodopsin als mögliche Behandlung von Blindheit)

Weblinks

Channelrhodopsin mediating optical activation of neurons (englisch)
Optogenetics Resource Center (englisch)