Quelltext der Seite Thermostabile DNA-Polymerase

[[Datei:Taq.png|mini|''Taq''-DNA-Polymerase mit Exonuklease- (oben links) und Polymerasedomäne mit DNA (unten rechts)]]
'''Thermostabile DNA-Polymerasen''' sind [[DNA-Polymerase]]n, die von [[Thermophil]]en, zumeist [[Bakterien]]- oder [[Archaeen]]arten, entstammen und daher [[Thermostabilität|thermostabil]] sind. Sie werden zur [[Polymerasekettenreaktion]] und verwandten Methoden zur Vervielfältigung und Modifikation von [[DNA]] verwendet.

== Eigenschaften ==
Es wurden mehrere DNA-Polymerasen mit unterschiedlichen Eigenschaften beschrieben, die ihren spezifischen Einsatz bei einer PCR, einer [[Real Time Quantitative PCR|Real-Time-PCR]] oder einer [[Isotherme DNA-Amplifikation|isothermen Amplifikation]] bestimmen. Als DNA-Polymerasen weisen die thermostabilen DNA-Polymerasen alle eine 5'→3'-Polymeraseaktivität sowie entweder eine 5'→3'- oder eine 3'→5'-Exonukleaseaktivität auf.
{| class="wikitable sortable"
|+ Eigenschaften thermostabiler DNA-Polymerasen
|-
! Polymerase
! Taq
! Tth (Tfl)<ref>Tfl bezeichnet ''Thermus flavus'', der keine offizielle Bezeichnung ist. Analysen der 16S rRNA haben Tfl als identisch mit Tth bestätigt.{{cite web |title=Thermus flavus AT-62 16S ribosomal RNA (rnn) gene sequence - Nucleotide - NCBI |url=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/155077?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=9&RID=ZW5S0T6R01S |website=www.ncbi.nlm.nih.gov}}</ref>
! Bst [[Klenow-Fragment]] (BF)
! Tli (Vent)
! Deep Vent
! Pfx (KOD)
! Pfu (Pwo)<ref>Die DNA-Polymerase und die 16S rRNA von ''P. woesei'' sind identisch mit der von ''P. furiosus''.</ref>
|-
! scope="row"|Organismus
|''[[Thermus aquaticus]]''
|''[[Thermus thermophilus]]''
|''[[Geobacillus stearothermophilus]]''<ref>Früher als ''Bacillus'' bezeichnet, daher das „B“ in ''Bst''.</ref>
|''[[Thermococcus litoralis]]''
|''[[Pyrococcus]]'' sp. GB-D<ref>Zu Stamm GB-D existieren wenige Daten. Alle verfügbaren Sequenzen (U00707.1, AB022670.1) sind identisch mit Teilen des Genoms von ''Pyrococcus kukulkanii'' LMOA42.</ref>
|''[[Thermococcus kodakarensis]]''<ref>Früher als ''Pyrococcus kodakarensis'' bezeichnet.</ref>
|''[[Pyrococcus furiosus]]''
|-
! scope="row"|Ursprung
|bakteriell
|bakteriell
|bakteriell
|archaeisch
|archaeisch
|archaeisch
|archaeisch
|-
! scope="row"|Molekulargewicht
| 80kDa<ref name="Promega">[http://www.promega.com/~/media/Files/Resources/Technical%20References/Properties%20of%20Thermostable%20DNA%20Polymerases.pdf Promega: Properties of Thermostable DNA Polymerases] (PDF; 208&nbsp;kB). Accessed september 27, 2012.</ref>
| 94kDa<ref name="Promega" />
| 67kDa<ref name="Oscorbin">{{cite journal | author = Oscorbin I., Filipenko M. | year = 2023| title = 2023 Bst polymerase - a humble relative of Taq polymerase | journal = Computational and Structural Biotechnology Journal | volume = 21 | issue = | pages = 4519–4535 | doi = 10.1016/j.csbj.2023.09.008 | pmid = 37767105 | pmc = 10520511 }}</ref>
| 90kDa<ref name="Promega" />
| 90kDa<ref name="Takagi">{{cite journal | author = Takagi M., Nishioka M., Kakihara H., Kitabayashi M., Inoue H., Kawakami B., Oka M., Imanaka T. | year = 1997 | title = Characterization of DNA polymerase from Pyrococcus sp. strain KOD1 and its application to PCR. | journal = Appl. Environ. Microbiol. | volume = 63 | issue = 11| pages = 4504–4510 | pmid = 9361436 | doi = 10.1128/aem.63.11.4504-4510.1997 | pmc = 168769 | bibcode = 1997ApEnM..63.4504T }}</ref>
| 90kDa<ref name="Takagi" />
| 92kDa<ref name="Promega" />
|-
! scope="row"|Betriebstemperatur
| 74&nbsp;°C<ref name="Promega" />
| 74&nbsp;°C<ref name="Promega" />
| 65&nbsp;°C<ref name="Oscorbin" />
| 74&nbsp;°C<ref name="Promega" />
| 75&nbsp;°C<ref name="Takagi" />
| 75&nbsp;°C<ref name="Takagi" />
| 75&nbsp;°C<ref name="Promega" />
|-
! scope="row"|5'→3'-Exonuklease-Aktivität
| Ja<ref name="Promega" />
| Ja<ref name="Promega" />
| Nein<ref name="Oscorbin" />
| Nein<ref name="Promega" />
|
|
| Nein<ref name="Promega" />
|-
! scope="row"|3'→5'-Exonuklease-Aktivität
| Nein<ref name="Promega" />
| Nein<ref name="Promega" />
| Nein<ref name="Oscorbin" />
| Ja<ref name="Promega" />
| Ja<ref name="Takagi" />
| Ja<ref name="Takagi" />
| Ja<ref name="Promega" />
|-
! scope="row"|Reverse-Transkriptase-Aktivität
| Schwach<ref name="Promega" />
| Ja<ref name="Promega" />
| Schwach<ref name="Oscorbin" />
| Nein<ref name="Promega" />
|
|
| N/A<ref name="Promega" />
|-
! scope="row"|DNA-Enden
| 3'-A<ref name="Promega" />
| 3'-A<ref name="Promega" />
| 3'-A<ref name="Oscorbin" />
| 70 % ohne Überhang;<br /> 30 % Einzelbasen<ref name="Promega" />
| kein Überhang<ref name="Takagi" />
| kein Überhang<ref name="Takagi" />
| kein Überhang<ref name="Promega" />
|-
! scope="row"|Fehlerrate (Fehler pro Base und Verdopplung)
|8 × 10<sup>−6</sup><ref name="Cline" /><br />1,5 × 10<sup>−4</sup><ref name="Potapov">{{cite journal| author=Potapov V, Ong JL| title=Examining Sources of Error in PCR by Single-Molecule Sequencing. | journal=PLOS ONE | year= 2017 | volume= 12 | issue= 1 | pmid=28060945 | doi=10.1371/journal.pone.0169774 | doi-access=free | pmc=5218489 | bibcode=2017PLoSO..1269774P }}</ref><br />3-5,6 × 10<sup>−5</sup><ref name="McInerney">{{cite journal | author = McInerney P., Adams P., Hadi M. Z. | year = 2014| title = Error Rate Comparison during Polymerase Chain Reaction by DNA Polymerase. | journal = Molecular Biology International | volume = 2014 | issue = | doi = 10.1155/2014/287430 | doi-access = free| pmid = 25197572 | pmc = 4150459 }}</ref>
|
|1,5 × 10<sup>−5</sup><ref>{{Patent| Land=EP| V-Nr=0810288| Code=A2| Typ=Patentanmeldung| Titel=Neue DNA-Polymerase mit 3'-5' Proofreading Exonuklease Atkivität zur Korrekturlesung| A-Datum=1996-05-14| V-Datum=1997-12-03| Erfinder=Guo Fan Hong, Feng Zhai, Wei-Hua Huang}}</ref>
|2,8 × 10<sup>−6</sup><ref name="Cline" />
|2,7 × 10<sup>−6</sup><ref name="Cline" /><br />4.0 × 10<sup>−6</sup><ref name="Potapov" />
|3,5 × 10<sup>−6</sup><ref name="Arezi">{{cite journal |author=Bahram Arezi, Weimei Xing, Joseph A. Sorge, Holly H. Hogrefe |date=2003-10-15 |doi=10.1016/S0003-2697(03)00465-2 |issue=2 |pages=226–235 |periodical=[[Analytical Biochemistry]] |pmid=14511688 |title=Amplification efficiency of thermostable DNA polymerases |url=http://www.gene-quantification.de/arezi-2003.pdf |volume=321}}<!-- auto-translated from German by Module:CS1 translator --></ref><br />1.2 × 10<sup>−5</sup><ref name="Potapov" /><br />7.6 × 10<sup>−6</sup><ref name="McInerney" />
|1,3 × 10<sup>−6</sup><ref name="Hogrefe">H.H. Hogrefe, M. Borns, High fidelity PCR enzymes, in: C.W. Dieffenbach, G.S. Dveksler (Eds.), PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003.</ref><ref name="Cline" /><br />5.1 × 10<sup>−6</sup><ref name="Potapov" /><br />2.8 × 10<sup>−6</sup><ref name="McInerney" />
|-
! scope="row"|Syntheserate (Basen/Sek.)
|21–47<ref name="Oscorbin" /><br />61<ref name="Agilent">Agilent: [https://www.agilent.com/cs/library/technicaloverviews/public/Technical%20Note_High-Fidelity%20PCR%20Enzymes_5994-0929EN_.pdf ''High-Fidelity PCR Enzymes: Properties and Error Rate Determinations.'']</ref>
|
|191<ref name="Oscorbin" />
|
|23<ref name="Agilent" />
|120<ref name="EP1752534" /><br />106–138<ref name="Agilent" />
|9,3–25<ref name="Agilent" />
|-
! scope="row"|Prozessivität (Basen)
|10–42<ref name="Agilent" />
|
|
|
|<20<ref name="Agilent" />
|>300<ref name="Agilent" />
|6,4–20<ref name="Agilent" />
|}

== Bakterielle Polymerasen ==
Thermostabile DNA-Polymerasen natürlichen Ursprungs kommen unter anderem bei thermophilen Bakterien, Archaeen und deren [[Pathogen]]en vor. Unter den bakteriellen thermostabilen DNA-Polymerasen werden die [[Taq-Polymerase]], die ''Tfl''-Polymerase, die ''Tma''-Polymerase, die ''Tne''-Polymerase und die ''Tth''-Polymerase verwendet.<ref name="Cline" /><ref name="Villbrandt">B. Villbrandt, H. Sobek, B. Frey, D. Schomburg: ''Domain exchange: chimeras of Thermus aquaticus DNA polymerase, Escherichia coli DNA polymerase I and Thermotoga neapolitana DNA polymerase.'' In: ''Protein Eng.'', Bd. 13, Nr. 9, 2000, S. 645–654. PMID 11054459.</ref><ref>W. Abu Al-Soud, P. Râdström: ''Capacity of nine thermostable DNA polymerases to mediate DNA amplification in the presence of PCR-inhibiting samples.'' In: ''Appl. Environ. Microbiol.'', Bd. 64, Nr. 10, 1998, S. 3748–3753. PMID 9758794; {{PMC|106538}}.</ref>

Die zu den A-Typ-DNA-Polymerasen gehörenden bakteriellen thermostabilen DNA-Polymerasen besitzen neben der [[Nukleinsäure-Nomenklatur|5'→3']]-[[Polymerase]]-[[Katalysatoraktivität|Aktivität]] eine ''5'→3'-[[Exonuklease]]-Aktivität'' und erzeugen am 3'-Ende des neu erzeugten Stranges einen [[Adenosin]]-Überhang (engl. {{enS|sticky ends}}).
Die Prozessivität (engl. {{lang|en|''processivity''}}) beschreibt die durchschnittliche Anzahl an Basenpaaren, bevor eine Polymerase von der DNA-Vorlage (engl. ''{{lang|en|template}}'') abfällt. Die Prozessivität der verwendeten Polymerase begrenzt den maximalen Abstand des Primers zur Sonde in der [[real time quantitative PCR]]. Die Prozessivität einer Taq-Polymerase liegt bei etwa 200 Basenpaaren.

== Archaeische Polymerasen ==
[[Datei:Pfu Polymerase ribbon diagram.jpg|mini|''Pfu''-Polymerase mit zwei Magnesiumionen (graue Kugeln)]]
Häufig verwendete DNA-Polymerasen des B-Typs sind die aus verschiedenen Archaeen stammende [[Pfu-Polymerase]],<ref name="Cline">J. Cline, J. C. Braman, H. H. Hogrefe: ''PCR fidelity of pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases.'' In: ''[[Nucleic Acids Research]].'', Bd. 24, Nr. 18, 1996, S. 3546–3551. PMID 8836181; {{PMC|146123}}.</ref> die [[Pwo-Polymerase]], die ''KOD''-Polymerase,<ref>M. Takagi, M. Nishioka, H. Kakihara, M. Kitabayashi, H. Inoue, B. Kawakami, M. Oka, T. Imanaka: ''Characterization of DNA polymerase from Pyrococcus sp. strain KOD1 and its application to PCR.'' In: ''Appl. Environ. Microbiol.'', Bd. 63, Nr. 11, 1997, S. 4504–4510. PMID 9361436; {{PMC|168769}}.</ref> die ''Tli''-Polymerase (auch ''Vent'' genannt),<ref>H. Kong, R. B. Kucera, W. E. Jack: ''Characterization of a DNA polymerase from the hyperthermophile archaea Thermococcus litoralis. Vent DNA polymerase, steady state kinetics, thermal stability, processivity, strand displacement, and exonuclease activities.'' In: ''[[J Biol Chem]].'', Bd. 268, Nr. 3, 1993, S. 1965–1975. PMID 8420970.</ref> die ''Tag''-Polymerase,<ref>K. Böhlke, F. M. Pisani, C. E. Vorgias, B. Frey, H. Sobek, M. Rossi, G. Antranikian: ''PCR  performance of the B-type DNA polymerase from the thermophilic euryarchaeon Thermococcus aggregans improved by mutations in the Y-GG/A motif.'' In: ''Nucleic Acids Res.'', Bd. 28, Nr. 20, 2000, S. 3910–3917. PMID 11024170; {{PMC|110800}}.</ref> die ''Tce''-Polymerase,<ref>K. P. Kim, H. Bae, I. H. Kim, S. T. Kwon: Cloning, expression, and PCR application of DNA polymerase from the hyperthermophilic archaeon, Thermococcus celer. In: ''Biotechnol Lett.'' (2011), Bd. 33(2), S. 339–46. PMID 20953664.</ref> die ''Tgo''-Polymerase,<ref name="PMID14511688">{{Literatur |Autor=Bahram Arezi, Weimei Xing, Joseph A. Sorge, Holly H. Hogrefe |Titel=Amplification efficiency of thermostable DNA polymerases |Sammelwerk=[[Analytical Biochemistry]] |Band=321 |Nummer=2 |Datum=2003-10-15 |Seiten=226–235 |Online=[https://www.gene-quantification.de/arezi-2003.pdf PDF] |DOI=10.1016/S0003-2697(03)00465-2 |PMID=14511688}}</ref> die ''TNA1''-Polymerase,<ref name="Cho">Y. Cho, H. S. Lee, Y. J. Kim, S. G. Kang, S. J. Kim, J. H. Lee: ''Characterization of a dUTPase from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus onnurineus NA1 and its application in polymerase chain reaction amplification''. In: ''Mar Biotechnol (NY)'', Bd. 9, Nr. 4, 2007, S. 450–458. PMID 17549447.</ref> die ''Tpe''-Polymerase,<ref name="Lee">J. I. Lee, Y. J. Kim, H. Bae, S. S. Cho, J. H. Lee, S. T. Kwon: ''Biochemical properties and PCR performance of a family B DNA polymerase from hyperthermophilic euryarchaeon Thermococcus peptonophilus.'' In: ''Appl Biochem Biotechnol.'', Bd. 160, Nr. 6, 2010, S. 1585–1899. PMID 19440663.</ref> die ''Tthi''-Polymerase,<ref>D. Marsic, J. M. Flaman, J. D. Ng: ''New DNA polymerase from the hyperthermophilic marine archaeon Thermococcus thioreducens.'' In: ''Extremophiles'', Bd. 12, Nr. 6, 2008, S. 775–788. PMID 18670731.</ref> die ''Neq''-Polymerase<ref>J. G. Song, E. J. Kil, S. S. Cho, I. H. Kim, S. T. Kwon: ''An amino acid residue in the middle of the fingers subdomain is involved in Neq DNA polymerase processivity: enhanced processivity of engineered Neq DNA polymerase and its PCR application.'' In: ''Protein Eng. Des. Sel.'', Bd. 23, Nr. 11, 2010, S. 835–842. PMID 20851826.</ref> und die ''Pab''-Polymerase.<ref>J. Dietrich, P. Schmitt, M. Zieger, B. Preve, J. L. Rolland, H. Chaabihi, Y. Gueguen: ''PCR performance of the highly thermostable proof-reading B-type DNA polymerase from Pyrococcus abyssi.'' In: ''FEMS Microbiol Lett.'', Bd. 217, Nr. 1, 2002, S. 89–94. PMID 12445650.</ref>

Die zum B-Typ gehörenden Archaeen-Varianten erzeugen keinen Überhang (engl. {{lang|en|''blunt ends''}}, die ''Tli''-Polymerase macht bei etwa 30 % der Produkte einen Überhang) und besitzen anstatt der ''5'→3'-Exonuklease-Aktivität'' eine Aktivität zur Korrektur von Synthesefehlern (engl. {{lang|en|''proof-reading''}}), die ''3'→5'-Exonuklease-Aktivität''.<ref>E. M. Kennedy, C. Hergott, S. Dewhurst, B. Kim: The mechanistic architecture of thermostable Pyrococcus furiosus family B DNA polymerase motif A and its interaction with the dNTP substrate. In: ''[[Biochemistry]]'' (2009), Bd. 48(47), S. 11161–8. PMID 19817489; {{PMC|3097049}}.</ref><ref>T. Kuroita, H. Matsumura, N. Yokota, M. Kitabayashi, H. Hashimoto, T. Inoue, T. Imanaka, Y. Kai: Structural mechanism for coordination of proofreading and polymerase activities in archaeal DNA polymerases. In: ''J Mol Biol.'' (2005), Bd. 351(2), S. 291–8. PMID 16019029.</ref> Bei den archaeischen Polymerasen leidet bei der Erzeugung eines analogen Klenow-Fragments die Fehlerrate, da die korrigierende Exonuklease-Aktivität dabei entfernt wird.<ref name="Cline" /> Manche DNA-Polymerasen von Archaeen zeichnen sich weniger durch ihre Eignung zur Standard-PCR aus, sondern durch ihre verminderte Hemmung bei der Amplifikation von [[aDNA]].<ref>J. P. McDonald, A. Hall, D. Gasparutto, J. Cadet, J. Ballantyne, R. Woodgate: Novel thermostable Y-family polymerases: applications for the PCR amplification of damaged or ancient DNAs. In: ''Nucleic Acids Res.'' (2006), Bd. 34(4), S. 1102–11. PMID 16488882; {{PMC|1373694}}.</ref>

== Modifizierte Polymerasen ==
Durch [[Proteindesign]] wurde aus verschiedenen thermostabilen Polymerasen und der [[DNA-Klammer]] des thermostabilen [[DNA-bindendes Protein|DNA-bindenden Proteins]] ''SSo7d'' verschiedene [[Fusionsprotein]]e mit der niedrigen Fehlerrate archaeischer und der hohen Syntheserate bakterieller thermostabiler DNA-Polymerasen erzeugt (''Q5''-Polymerase).<ref>Y. Wang, D. E. Prosen, L. Mei, J. C. Sullivan, M. Finney, P. B. Vander Horn: A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro. In: ''Nucleic Acids Res.'' (2004), Bd. 32(3), S. 1197–207. PMID 14973201; {{PMC|373405}}.</ref> Auch wurde ein Fusionsprotein des [[PCNA]]-[[Homologie (Genetik)|Homologs]] aus ''Archaeoglobus fulgidus'' mit archaeischen thermostabilen DNA-Polymerasen erzeugt.<ref>M. Motz, I. Kober, C. Girardot, E. Loeser, U. Bauer, M. Albers, G. Moeckel, E. Minch, H. Voss, C. Kilger, M. Koegl: ''Elucidation of an archaeal replication protein network to generate enhanced PCR enzymes''. In: ''J Biol Chem.'' (2002), Band 277(18), S. 16179–88. PMID 11805086. [http://www.jbc.org/content/277/18/16179.full.pdf+html PDF].</ref> Analog wurden Fusionsproteine thermostabiler DNA-Polymerasen mit der thermostabilen DNA-bindenden [[Proteindomäne]] einer [[Topoisomerase]] (vom Typ&nbsp;V, mit ''Helix-hairpin-Helix-Motiv'', ''HhH'') aus ''Methanopyrus kandleri'' erzeugt (''TopoTaq'' und ''PfuC2'').<ref>{{Literatur |Autor=P. Forterre |Titel=DNA topoisomerase V: a new fold of mysterious origin |Sammelwerk=[[Trends Biotechnol]] |Band=Vol. 24 |Nummer=6 |Datum=2006 |Seiten=245–247 |DOI=10.1016/j.tibtech.2006.04.006 |PMID=16650908}}</ref><ref>{{Literatur |Autor=A. R. Pavlov, N. V. Pavlova, S. A. Kozyavkin, A. I. Slesarev |Titel=Recent developments in the optimization of thermostable DNA polymerases for efficient applications |Sammelwerk=Trends Biotechnol |Band=22 |Nummer=5 |Datum=2004 |Seiten=253–260 |DOI=10.1016/j.tibtech.2004.02.011 |PMID=15109812}}</ref> Ebenfalls durch Proteindesign wurde eine modifizierte ''Pfu''-Polymerase erzeugt (''Pfu Ultra'').<ref>Holly H. Hogrefe, M. Borns: ''High fidelity PCR enzymes''. In: C.W. Dieffenbach, G.S. Dveksler (Hrsg.): ''PCR Primer: A Laboratory Manual'', [[Cold Spring Harbor Laboratory]] Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003.</ref> Ähnliche Effekte werden auch mit Mischungen thermostabiler DNA-Polymerasen beider Typen mit einem Mischungsverhältnis der [[Enzymaktivität]]en der Polymerasen des Typs A und B von 30 zu 1 erzielt,<ref name="Lee" /><ref>W. M. Barnes: PCR amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from lambda bacteriophage templates. In: ''Proc Natl Acad Sci U S A'' (1994), Bd. 91(6), S. 2216–20. PMID 8134376; {{PMC|43341}}.</ref> z.&nbsp;B. die ''Herculase'' als kommerzielle Mischung der ''Taq''- und der ''Pfu''-Polymerase.<ref name="PMID14511688" />

Die Basissyntheseraten verschiedener Polymerasen (engl. {{lang|en|''productivity''}}) sind verglichen worden.<ref name="PMID14511688" /> Die Syntheserate der ''Taq''-Polymerase liegt bei etwa 60 Basenpaaren pro Sekunde. Unter den unmodifizierten thermostabilen DNA-Polymerasen liegt nur die Syntheserate der [[Thermococcus kodakarensis#Anwendung|''KOD''-Polymerase]] über 100 Basenpaaren pro Sekunde (circa 120 bp/s).<ref name="EP1752534">{{Patent| Land=EP| V-Nr=1752534A1| Typ=Patentanmeldung| Titel=Hochgeschwindigkeits-PCR unter Verwendung von Hochgeschwindigkeits-DNA-Polymerase| A-Datum=2005-05-12| V-Datum=2007-02-14| Anmelder=Toyo Boseki| Erfinder=Masaya Segawa et al.}}</ref> Unter den modifizierten thermostabilen DNA-Polymerasen sind verschiedene Mutationen beschrieben worden, die die Syntheserate steigern.<ref>{{Patent| Land=US| V-Nr=2013034879A1| Typ=Patentanmeldung| Titel=DNA Polymerases| A-Datum=2012-08-02| V-Datum=2007-02-14| Anmelder=Fermentas UAB et al.| Erfinder=Remigijus Skirgaila et al.}}</ref><ref>{{Patent| Land=US| V-Nr=2009280539A1| Typ=Patentanmeldung| Titel=DNA Polymerases and related methods| A-Datum=2009-04-16| V-Datum=2009-11-12| Anmelder=Roche Molecular Systems Inc| Erfinder=Keith A. Bauer}}</ref> Die ''KOD''-Polymerase und einige modifizierte thermostabile DNA-Polymerasen (''iProof'', ''Pfu Ultra'', ''Phusion'', ''Velocity'' oder ''Z-Taq'') werden aufgrund ihrer hohen Syntheserate zu einer PCR-Variante mit kürzeren Amplifikationszyklen eingesetzt (''Fast-PCR'', ''High-speed PCR'').

Die Fehlerraten verschiedener Polymerasen (engl. {{lang|en|''fidelity''}}) sind bekannt und beschrieben worden. Die Fehlerrate der ''Taq''-Polymerase beträgt 8&nbsp;·&nbsp;10<sup>−6</sup> Fehler pro [[Basenpaar]], die der ''KOD''-Polymerase 3,5&nbsp;·&nbsp;10<sup>−6</sup> Fehler pro Basenpaar, die der ''Tli''-Polymerase und der ''Herculase'' 2,8&nbsp;·&nbsp;10<sup>−6</sup> Fehler pro Basenpaar, die der ''Pfu''-Polymerase 1,3&nbsp;·&nbsp;10<sup>−6</sup> Fehler pro Basenpaar und die der ''Pfu Ultra'' 4,3&nbsp;·&nbsp;10<sup>−7</sup> Fehler pro Basenpaar.<ref name="Cline" /><ref name="PMID14511688" />

Bei den bakteriellen thermostabilen DNA-Polymerasen kann, analog zu der DNA-Polymerase aus ''[[E. coli]]'' durch [[Deletion]] der Exonuklease-[[Proteindomäne|Domäne]] im Zuge eines Proteindesigns ein [[Klenow-Fragment]] (''Klen-Taq'') oder ein [[Stoffel-Fragment]] erzeugt werden, was in einer höheren Produktkonzentration resultiert.<ref name="Villbrandt" /><ref>W. M. Barnes: ''The fidelity of Taq polymerase catalyzing PCR is improved by an N-terminal deletion''. In: ''Gene'' (1992), Band 112(1), S. 29–35. PMID 1551596.</ref> Zwei für die Exonukleasefunktion der ''Taq''-Polymerase notwendige [[Aminosäure]]n wurden durch [[Mutagenese]] als [[Arginin]]e an den Positionen 25 und 74 (R25 und R74) identifiziert.<ref>L. S. Merkens, S. K. Bryan, R. E. Moses: ''Inactivation of the 5'-3' exonuclease of Thermus aquaticus DNA polymerase.'' In: ''Biochim Biophys Acta'' (1995), Band 1264(2), S. 243–8. PMID 7495870.</ref>

Die Bevorzugung einzelner Nukleotide durch eine thermostabile DNA-Polymerase wird als Nukleotidspezifität (engl. ''{{lang|en|bias}}'' ‚Vorliebe‘, ‚Voreingenommenheit‘) bezeichnet. Bei der PCR-basierten [[DNA-Sequenzierung]] mit Kettenabbruchsubstraten ([[Didesoxymethode]]) ist oftmals deren gleichmäßiger Einbau und somit eine gleichmäßige Erzeugung aller Kettenabbruchprodukte erwünscht, um eine höhere Sensitivität und eine leichtere Auswertung zu ermöglichen. Hierzu wurde eine ''KlenTaq''-Polymerase durch Deletion erzeugt und durch [[ortsspezifische Mutagenese]] ein Phenylalanin an Position 667 gegen Tyrosin getauscht (kurz: F667Y) und als ''Thermo Sequenase'' bezeichnet.<ref>S. Tabor, C. C. Richardson: ''A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides.'' In: ''Proc Natl Acad Sci U S A.'', Band 92, Nr. 14, 1995, S. 6339–6343. PMID 7603992; {{PMC|41513}}.</ref><ref>P. B. Vander Horn, M. C. Davis, J. J. Cunniff, C. Ruan, B. F. McArdle, S. B. Samols, J. Szasz, G. Hu, K. M. Hujer, S. T. Domke, S. R. Brummet, R. B. Moffett, C. W. Fuller: ''Thermo sequenase DNA polymerase and T. acidophilum pyrophosphatase: new thermostable enzymes for DNA sequencing.'' In: ''Biotechniques'', Band 22, Nr. 4, 1997, S. 758–762, 764–765. PMID 9105629.</ref> Diese Polymerase kann auch für den Einbau [[Fluoreszenz]]-markierter [[Didesoxyribonukleosid-Triphosphate|Didesoxynukleotide]] verwendet werden.<ref>J. M. Prober, G. L. Trainor, R. J. Dam, F. W. Hobbs, C. W. Robertson, R. J. Zagursky, A. J. Cocuzza, M. A. Jensen, K. Baumeister: ''A system for rapid DNA sequencing with fluorescent chain-terminating dideoxynucleotides.'' In: ''Science'', Band 238, Nr. 4825, 1987, S. 336–341. PMID 2443975.</ref>

=== Andere DNA-Polymerasen ===
Die in den [[Isothermale DNA-Amplifikation|isothermalen DNA-Amplifikationen]], z.&nbsp;B. bei der [[Multidisplacement Amplification]], der [[Recombinase Polymerase Amplification]] oder dem [[Isothermal Assembly]], zur Amplifikation ganzer [[Genom]]e eingesetzten DNA-Polymerasen (z.&nbsp;B. die [[φ29-DNA-Polymerase]] aus dem Bakteriophagen ''phi29'') sind nicht thermostabil. Die [[T4-DNA-Polymerase|''T4''-]], die ''T6''- und die ''T7''-DNA-Polymerase sind ebenfalls nicht thermostabil.

== Anwendungen ==
{{Hauptartikel|PCR-Optimierung}}
Neben der Wahl der eingesetzten thermostabilen DNA-Polymerase werden im Zuge einer PCR-Optimierung weitere Parameter einer PCR gezielt verändert.

Die thermostabilen DNA-Polymerasen werden neben der PCR auch für die Varianten der [[RT-PCR]], der [[qPCR]] in verschiedenen Varianten, der [[Ortsspezifische Mutagenese|ortsspezifischen Mutagenese]] und der [[DNA-Sequenzierung]] eingesetzt. Daneben werden damit auch [[Hybridisierungssonde]]n für [[Southern Blot]] und [[Northern Blot]] durch [[Random priming]] hergestellt. Die ''5'→3'-Exonuklease-Aktivität'' wird, ohne dass eine DNA-Vermehrung ([[Amplifikation (Genetik)|Amplifikation]]) stattfindet, unter anderem zur [[Nick translation]] und zur [[TaqMan]] eingesetzt.

== Literatur ==
* [[Joseph Sambrook|J. Sambrook]], T. Maniatis, D. W. Russel: ''Molecular cloning: a laboratory manual''. [[Cold Spring Harbor Laboratory]] Press; 3rd edition (2001), ISBN 0-87969-577-3.
* Cornel Mülhardt: ''[[Der Experimentator]]: Molekularbiologie/Genomics'', Springer 2008, ISBN 3-8274-2036-9.

== Weblinks ==
* [https://www.promega.com/~/media/Files/Resources/Technical%20References/Properties%20of%20Thermostable%20DNA%20Polymerases.pdf Promega: Properties of Thermostable DNA Polymerases] (PDF; 208&nbsp;kB). Abgerufen am 27. September 2012.
* [https://polbase.neb.com/references/3648 NEB Polbase]. Abgerufen am 27. September 2012.
* [http://www.fermentas.com/en/products/all/modifying-enzymes/thermophilic-polymerases Fermentas DNA-Polymerasen]. Abgerufen am 27. September 2012.

== Einzelnachweise ==
<references />

[[Kategorie:Nukleotidyltransferase]]
[[Kategorie:Chemikaliengruppe]]
[[Kategorie:Biotechnologie]]