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Thermolysin

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Thermolysin }}
Bändermodell nach PDB 2A7G. Die Zink-Bindungsstellen sind gelb, andere katalytische Aminosäuren orange, Zink hellblau, Calcium lachsfarben.
Thermolysin }}
Andere Namen

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Eigenschaften des menschlichen Proteins

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Masse/Länge Primärstruktur 316 Aminosäuren

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Sekundär- bis Quartärstruktur

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Kofaktor Zn2+; 4 Ca2+

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Präkursor

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Isoformen

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Bezeichner
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Arzneistoffangaben
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Produkte 
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Vorkommen
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Bakterien }}
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Thermolysin ist ein thermostabiles Enzym, das zur Gruppe der Metallopeptidasen gehört. Es wird vom thermophilen Bakterium Bacillus thermoproteolyticus sezerniert.<ref>Endo, S. (1962). Studies on protease produced by thermophilic bacteria. In: J. Ferment. Technol. 40; 346–353.</ref> Als Endoprotease katalysiert es die Spaltung von Peptidbindungen; dabei erfolgt die Hydrolyse der Peptidbindung vor großen, hydrophoben Resten (P1' Aktivität), (beispielsweise nach Leucin, Isoleucin oder Phenylalanin) innerhalb des Polypeptides.<ref>Morihara, K. und Tsuzuki, H. (1970): Thermolysin: kinetic study with oligopeptides. In: Eur J Biochem. 15(2); 374–80; PMID 4993757.</ref>

Das Enzym trägt die EC-Nummer EC 3.4.24.27.

Allgemeines

Thermolysin gehört zu den Zink enthaltenden Metalloproteasen und ist eines der bestuntersuchten Enzyme dieser Superfamilie. Die dreidimensionale Struktur wurde bereits 1972 von Matthews und Mitarbeitern in einer Auflösung von 2,3 Å aufgeklärt, mittlerweile wurde eine Auflösung von 1,6 Å erreicht.<ref>Colman PM. et al. (1972): The structure of thermolysin: an electron density map at 2-3 Å resolution. In: J Mol Biol. 70(3): 701–24; PMID 5083153.</ref><ref>Weaver LH. et al. (1976): The structure and stability of thermolysin. In: Experientia Suppl. 26; 31–9; PMID 820566.</ref>

Struktur

Thermolysin hat eine molare Masse von 34,6 kDa. Das Enzym hat eine N-terminale und eine C-terminale Domäne, die eine Spalte für sein aktives Zentrum ausbilden. Die N-terminale Domäne besteht hauptsächlich aus β-Faltblättern, die stabilere C-terminale Domäne aus α-Helices.<ref name="Roche">Roche, RS. und Voordouw, G. (1978): The structural and functional roles of metal ions in thermolysin. In: CRC Crit Rev Biochem. 5(1); 1–23; PMID 357082.</ref>

Thermolysin benötigt ein Zinkion und vier Calciumionen. Ersteres ist für die Enzymaktivität essentiell, trägt aber kaum zur Thermostabilität bei. Das Zinkion findet sich im aktiven Zentrum. Die Thermostabilität wird durch die Calciumionen vermittelt.<ref>Tajima, M. et al. (1976): Role of calcium ions in the thermostability of thermolysin and Bacillus subtilis var. amylosacchariticus neutral protease. In: Eur J Biochem. 64(1); 243–7; PMID 819262.</ref> Die Calciumionen stabilisieren die strukturelle Integrität und schützen die aus der Oberfläche des Enzyms ragenden Schleifen (loops) vor Autoproteolyse („Selbstverdauung“).<ref>W. Kaim/B. Schwederski, Bioanorganische Chemie, Teubner Studienbücher, 1995, ISBN 3-519-13505-1, S. 261.</ref>

Das Protein besitzt keine Disulfidbrücken.

Chemische Eigenschaften

Die Endoprotease ist thermostabil, ihr Funktionsoptimum liegt zwischen 65 und 70 °C bei pH 8,0.<ref>Datenblatt <templatestyles src="Webarchiv/styles.css" />{{#if:20140219113810 

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  }} (PDF; 104 kB) der Firma Daiwa Kasei K.K.</ref> Bei 80 °C liegt seine strukturelle Halbwertszeit bei einer Stunde.<ref name="Rao">Rao, MB. et al. (1998): Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. In: Microbiol Mol Biol Rev. 62(3); 597–635; PMID 9729602; PDF (freier Volltextzugriff, engl.).</ref> Eine Hitzedenaturation von Thermolysin erfolgt jedoch schnell und irreversibel. Dies geschieht durch Entfaltung und Autoproteolyse exponierter Sequenzen.<ref name="Roche" />

Katalysemechanismus

Datei:Thermolysin detail 2A7G.png
Detail des Bändermodell nach PDB 2A7G.

Obzwar viele Daten über Kristallstrukturanalysen, Mutageneseexperimente und Untersuchungen der Reaktionskinetik vorliegen, steht der exakte Katalysemechanismus noch zur Debatte. Mit Hilfe von Computersimulationen aus kristallographischen Daten gilt aber folgender Reaktionsmechanismus als der wahrscheinlichste.

Im nativen Zustand liegt das Zinkion tetraedrisch koordiniert vor. Dabei bildet das Metallion einen Komplex zu drei Aminosäureresten des Enzyms (Histidin 142 (His 142), Histidin 146 (His 146) und Glutaminsäure 166 (Glu 166)) und einem Wassermolekül (vgl. auch untenstehende Abbildung). Letzteres ist allen Zink-Metalloproteinen gemeinsam.

Nach Binden des zu hydrolisierenden Peptids (Schritt 1 in der Abbildung) liegt das Zinkion pentakoordiniert vor. Gleichzeitig wird das Wassermolekül in Nähe des Glutamats 143 (Glu 143) gebracht und von diesem und dem positiv geladenen Zinkatom stark polarisiert. Dies hat zur Folge, dass die Nukleophilie des Wassermoleküls groß genug wird, um die Peptidbindung anzugreifen.

Der nukleophile Angriff (Schritt 2) auf die Peptidbindung erfolgt, dabei wird das eine Proton des Wassers durch das Glu 143 zum Stickstoff übertragen. Das Kohlenstoffatom der Peptidbindung liegt nun tetraedrisch vor. His 231 und Tyrosin (Tyr) 157 helfen dabei, den Carbonylsauerstoff zu stabilisieren. Schließlich erfolgt die Spaltung der Peptidbindung, dabei wird das zweite vom Wasser stammende Proton via Glu 143 auf das Stickstoffatom übertragen.

Das Aminprodukt verlässt das aktive Zentrum als protonierte Form (Schritt 3). Das Carboxylprodukt wird durch ein neues Wassermolekül ersetzt (Schritt 4), so dass das Zinkatom wieder tetraedrisch koordiniert vorliegt. Ein neuer Reaktionsmechanismus kann beginnen.

Der Glu-143-Rest formt mit den beiden Histidinen His 142 und 146 ein sogenanntes übereinstimmendes Sequenzmotiv, das HEXXH-Motiv. Dieses Motiv ist in allen Vertretern der Zinkendoproteasen mit einem Zinkatom hochkonserviert.

Datei:Thermolysin reaction cycle.png
Katalysemechanismus Thermolysins. Einzelheiten sind dem Text zu entnehmen.

Inhibitoren

Ein natürlicher Inhibitor von Thermolysin ist Phosphoramidon<ref group="S">Vorlage:Substanzinfo</ref> aus Streptomyces tanashiensis. Der zurzeit wirksamste Hemmstoff ist das artifizielle ZFpLA (Carbobenzoxy-L-PheP-L-Leu-L-Ala).<ref group="S">Vorlage:Substanzinfo</ref> In beiden Fällen liegt ein Phosphoramidat vor (eine kovalente Verbindung zwischen einem Stickstoff- und einem Phosphoratom).

Datei:Phosphoramidon.svg
Phosphoramidon, ein natürlicher Hemmstoff
Datei:4tmn.svg
Der wirksamste künstliche Inhibtor ist ZFpLA

Technische Anwendungen

Das Enzym kann für die Synthese von Aspartam, einem Süßstoff, verwendet werden.<ref name="Rao" /> Dabei wird die Kondensation – also die Umkehrreaktion der Hydrolyse (reverse proteolysis) – von L--Aspartat und L-Phenylalanin zu L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester (=Aspartam) katalysiert.<ref>Arnold Ulrich: Limitierte Proteolyse zur Analyse lokaler und globaler Änderungen der Proteinstruktur am Beispiel von Ribonucleasen. Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, Habilitationsschrift, 2008, S. 35–36.</ref>

Literatur

  • Matthews, BW. (1988): Structural basis of the action of thermolysin and related zinc peptidases. In: Acc. Chem. Res. 21(9); 333–340; doi:10.1021/ar00153a003
  • Pelmenschikov, V. et al. (2002): A theoretical study of the mechanism for peptide hydrolysis by thermolysin. J Biol Inorg Chem. 7(3); 284–98; PMID 11935352; doi:10.1007/s007750100295

Weblinks

Einzelnachweise

<references />

Externe Links zu erwähnten Verbindungen

<references group="S" />

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