Zum Inhalt springen

Affinitätschromatographie

aus Wikipedia, der freien Enzyklopädie

Die Affinitätschromatographie (manchmal ungebräuchliches Synonym: Proteinaffinitätschromatographie) ist ein chromatographisches Trennverfahren zur Isolation eines Analyten aus einer Lösung verschiedener Stoffe. Voraussetzung ist, dass ein geeigneter Ligand (Bindungspartner) zu dem interessierenden Analyten (Protein) zur Verfügung steht. Sie ist eine der leistungsfähigsten Trennmethoden. Die verwendeten Säulen sind jedoch relativ kostspielig, so dass das Verfahren nur in besonderen Fällen beziehungsweise im kleinen Maßstab (Labormaßstab) zum Einsatz kommt.

Prinzip

Datei:Affinity chromatography german.svg
Prinzip einer Affinitätschromatographie (hier: Säulenchromatographische Variante)
Datei:Affinität Säule.jpg
Batch-Chromatographie

Die Trennung erfolgt meist in Säulen, kann aber auch im Batchverfahren vorgenommen werden. Der Reinigungseffekt dieser Methode basiert entweder auf der spezifischen Erkennung eines Proteins durch einen Antikörper oder bei Enzymen auf Ausnutzung der spezifischen Affinität eines Enzyms zu einem Inhibitor, Substrat oder Cofaktor.

Die stationäre Phase, oft ein Gel, z. B. aus Dextranen oder quervernetzter Agarose (Handelsname Sepharose), wird mit einem geeigneten Liganden (z. B. Antikörper bzw. Immunglobulinen) gekoppelt, der spezifisch den zu reinigenden Analyten bindet. Hierbei ist in der Praxis darauf zu achten, dass die Affinität gegen den Analyten nicht zu hoch ist, da die Elution dadurch erschwert wird. Umgekehrt kann zur präparativen Reinigung von Antikörpern auch eine stationäre Phase mit einem Protein (meist Protein A, G oder L) verwendet werden, das bestimmte Immunglobulinklassen bindet.

Zur Bindung eines Liganden auf dem Trägermaterial wird dieses vorher in eine aktivierte Form überführt. Beim Beispiel der Agarose kommt die Bromcyan-Aktivierungsmethode in Betracht, bei der reaktive Imidocarbonat-Gruppen erzeugt werden, die mit Aminogruppen des Analyten unter Ausbildung einer kovalenten Bindung reagieren. Nach der Fixierung eines niedermolekularen Liganden auf der Matrix (z. B. aktivierte Agarose) kann es zu sterischer Hinderung kommen, wenn der Analyt höhermolekular ist. In diesem Fall kann der Ligand über ein Brückenglied (Spacer) an die Matrix gekoppelt werden. Als Spacer werden normalerweise kurze Kohlenwasserstoffketten verwendet, die dann gewissermaßen aus der Matrixoberfläche herausragen.

Für die Bindung von Ligand und Zielprotein ist die Assoziationskonstante, die sich aus der Gleichgewichtskonstanten ableitet, von Bedeutung. Je größer diese ist, desto günstiger verläuft die affinitätschromatographische Trennung. Der Wert sollte mindestens bei KAss = 104 mol−1 liegen.

Anwendung

Primär benutzt man die Affinitätschromatographie zum Reinigen und Konzentrieren einer Substanz aus einer Mischung in eine Pufferlösung oder zum Reduzieren einer Substanzmenge in einer Mischung. Auch um festzustellen, welche biologischen Verbindungen an eine bestimmte Substanz binden, oder zum Reinigen und Konzentrieren einer Enzymlösung, wird die Affinitätschromatographie häufig verwendet.

Durchführung

Zur Ausführung affinitätschromatographischer Arbeiten werden heute meist biokompatible Anlagen der HPLC eingesetzt, die jedoch hier nur mit geringeren Drücken von bis zu 150 bar betrieben werden. Sogenannte FPLC-Anlagen (für englisch fast protein liquid chromatography) arbeiten sogar mit deutlich geringeren Drücken von oft unter 10 bar. Das zu trennende Gemisch wird in der Regel über Probenschleifen oder über Probenpumpen auf die Säule aufgegeben und der Analyt durch die Liganden gebunden. Alle anderen Stoffe eluieren schnell, da sie mit dem Liganden nicht stark wechselwirken. Nach einem Waschschritt, um unspezifisch gebundene Verunreinigungen zu entfernen, wird der am Liganden gebundene Analyt durch Veränderung der Bedingungen (z. B.: anderer Puffer) ebenfalls eluiert. Als Elutionsmittel wird oft ein saurer Puffer oder ein Lösungsmittel/Wasser-Gemisch verwendet. Alternativ können auch kompetitiv zum Zielprotein agierende Substanzen oder ein Überschuss an freien Liganden zugesetzt werden. Das Eluat enthält den gereinigten und angereicherten Analyten. Das Batchverfahren ähnelt sehr stark der Vorgehensweise des zuvor erläuterten Säulenbetriebs. Wichtiger Unterschied ist jedoch die Nutzung von Zentrifugation und weiterer Trennmethoden, welche druckunabhängig sind. Je nach Bedarf können auch beide Verfahren untereinander kombiniert werden, in dem der Säulenbetrieb nach dem Batchverfahren folgt.

Neuere Entwicklungen basieren auf der Verwendung von mehreren hintereinander geschalteten Säulen. Hierbei können die teuren Liganden bis zur maximalen Belegung genutzt werden. In Ein-Säulen-Prozessen ist dies nicht möglich, da ein Teil des Produktes nicht mehr gebunden wird und somit eluiert und verloren ginge. In Mehrsäulenprozessen wird dieses Eluat in einer weiteren Säule aufgefangen. Durch abwechselndes Beladen und Eluieren der Säulen wird ein periodischer Prozess erreicht, der oft als kontinuierliche Chromatographie bezeichnet wird. Dies kann bereits mit zwei Säulen effizient umgesetzt werden; weitere Säulen verringern die Effizienz wiederum.<ref>{{#invoke:Vorlage:Literatur|f}}</ref>

Spezielle Verfahren

Die Affinitätschromatographie findet spezielle Verwendungen in der Aufreinigung von Nukleinsäuren, Proteinen oder Blut. Beispiele hierfür sind u. a. der His-Tag oder der Strep-tag<ref>{{#invoke:Vorlage:Literatur|f}}</ref> zur Aufreinigung rekombinanter Proteine:

1. Immunaffinität: Reinigung von Antikörpern aus Blutseren
2. Immobilisierte-Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC): Beruht auf der kovalenten Bindung von Aminosäuren, insbesondere Histidin, an Metallen
3. Rekombinante Proteine
4. Lektine: Proteine, welche Kohlenhydrate binden, um Substanzen in der Probe zu trennen.<ref>{{#if:2015-01-20|{{#iferror: {{#iferror:{{#invoke:Vorlage:FormatDate|Execute}}|}}| |}}}}{{#if:|{{{autor}}}: }}{{#if:https://web.archive.org/web/20150120024912/http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/%7C{{#if:Immobilized Lectin|[{{#invoke:Vorlage:Internetquelle|archivURL|1={{#invoke:URLutil|getNormalized|1=https://web.archive.org/web/20150120024912/http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/}}}} {{#invoke:Vorlage:Internetquelle|TitelFormat|titel=Immobilized Lectin}}]{{#if:| ({{{format}}})}}{{#if:| {{{titelerg}}}{{#invoke:Vorlage:Internetquelle|Endpunkt|titel={{{titelerg}}}}}}}}}|{{#if:https://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/de/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/%7C{{#if:{{#invoke:TemplUtl%7Cfaculty%7Cja}}%7C{{#invoke:Vorlage:Internetquelle%7CTitelFormat%7Ctitel={{#invoke:WLink%7CgetEscapedTitle%7C1=Immobilized Lectin}}}}|[{{#invoke:URLutil|getNormalized|1=https://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/de/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/}} {{#invoke:Vorlage:Internetquelle|TitelFormat|titel={{#invoke:WLink|getEscapedTitle|1=Immobilized Lectin}}}}]}}{{#if:| ({{{format}}}{{#if:jagelifesciences.comGE Healthcare Lifescienceshttps://web.archive.org/web/20150120024912/http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/{{#if: 2024-07-01 | {{#if:{{#invoke:TemplUtl|faculty|}} 1}}}} ) de 1}}}}| ; {{{titelerg}}}{{#invoke:Vorlage:Internetquelle|Endpunkt|titel={{{titelerg}}}}}}}}}}}{{#if:https://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/de/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/%7C{{#if:{{#invoke:URLutil%7CisResourceURL%7C1=https://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/de/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/}} }}}}{{#if:Immobilized Lectin|{{#if:{{#invoke:WLink|isValidLinktext|1=Immobilized Lectin|lines=0}} }}}}{{#if: gelifesciences.com| In: {{#invoke:Vorlage:Internetquelle|TitelFormat|titel=gelifesciences.com}}}}{{#if: GE Healthcare Lifesciences| GE Healthcare Lifesciences{{#if: https://web.archive.org/web/20150120024912/http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/%7C,%7C{{#if: 2024-07-01 | {{#if:{{#invoke:TemplUtl|faculty|}}|;|,}}}}}}}}{{#if: | {{#if:{{#invoke:DateTime|format|{{{datum}}}|noerror=1}} format|{{{datum}}}|T._Monat JJJJ}} failure|1=Fehler bei Vorlage:Internetquelle, datum={{{datum}}}|class=Zitationswartung}} }}{{#if: https://web.archive.org/web/20150120024912/http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/%7C,%7C{{#if: 2024-07-01 | {{#if:{{#invoke:TemplUtl|faculty|}}|;|,}}}}}}}}{{#if: | S. {{{seiten}}}{{#if: https://web.archive.org/web/20150120024912/http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/%7C,%7C{{#if: 2024-07-01 | {{#if:{{#invoke:TemplUtl|faculty|}}|;|,}}}}}}}}{{#if: https://web.archive.org/web/20150120024912/http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/{{#invoke:TemplUtl%7Cfaculty%7Cja}}%7C+{{#if:GE Healthcare Lifesciences|{{#if:https://web.archive.org/web/20150120024912/http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/%7Carchiviert%7Cehemals}}%7C{{#if:https://web.archive.org/web/20150120024912/http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/%7CArchiviert%7CEhemals}}}}+{{#if:https://web.archive.org/web/20150120024912/http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/%7Cvom%7Cim}}+Vorlage:Referrer{{#if:{{#invoke:TemplUtl|faculty|ja}}| (nicht mehr online verfügbar)}}{{#if: 2015-01-20| am {{#iferror: {{#iferror:{{#invoke:Vorlage:FormatDate|Execute}}|}}|2015-01-20{{#if:233654 ;}}}}{{#if: 2024-07-01| {{#if:GE Healthcare Lifescienceshttps://web.archive.org/web/20150120024912/http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/{{#invoke:TemplUtl%7Cfaculty%7Cja}}%7Cabgerufen%7CAbgerufen}} {{#switch: {{#invoke:Str|len| {{#invoke:DateTime|format| 2024-07-01 |ISO|noerror=1}} }} 4=im Jahr 7=im 10=am failure|1=Fehler bei Vorlage:Internetquelle, abruf=2024-07-01|class=Zitationswartung}} }} {{#invoke:DateTime|format|2024-07-01|T._Monat JJJJ}} failure|1=Vorlage:Internetquelle | abruf=2026-MM-TT ist Pflichtparameter}} }}{{#if:{{#ifeq:de|de 1}}}}|{{#if:jagelifesciences.comGE Healthcare Lifescienceshttps://web.archive.org/web/20150120024912/http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/{{#if: 2024-07-01 | {{#if:{{#invoke:TemplUtl|faculty|}} 1}}}} ( | (}} 
       }}{{#ifeq:{{#if:de|de|de}}|de||
          {{#invoke:Multilingual|format|{{{sprache}}}|slang=!|split=[%s,]+|shift=m|separator=, }}}}{{#if: |{{#ifeq:{{#if:de|de|de}}|de||, }}{{{kommentar}}}}})}}{{#if: https://web.archive.org/web/20150120024912/http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/{{#if: 2024-07-01 | {{#if:{{#invoke:TemplUtl|faculty|}}||1}} }}|{{#if: |: {{
 #if:
„{{ 
     #ifeq: {{#if:{{#if: {{#invoke:templutl|faculty|}}|de-ch|de}}|{{#if: {{#invoke:templutl|faculty|}}|de-ch|de}}|de}} | de
Vorlage:Str trim flat}} 
     }}“
faculty|}}|de-ch|de}}|{{#if: {{#invoke:templutl|faculty|}}|de-ch|de}}|de}} | de „Vorlage:Str trim“ quote 1={{#if: flat}} flat}} }} faculty|}}|de-CH|de}} 3=1}} }}

}}{{#if:

: }}{{#if: | , deutsch: „“ }}) {{#if: , deutsch: „“ }}) (deutsch: „“) }} 
 }}

}}{{#if: {{{zitat}}}

{{#if: {{#if: {{{zitat}}} Vorlage:": Text= und 1= gleichzeitig, bzw. Pipe zu viel }} }} Vorlage:": Text= fehlt }}{{#if: | {{#if: {{#invoke:Text|unstrip|{{{ref}}}}} Vorlage:": Ungültiger Wert: ref= {{{ref}}} }}

}}|.{{#if:{{#invoke:TemplUtl|faculty|ja}}|{{#if:https://web.archive.org/web/20150120024912/http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/%7C%7C{{#ifeq: ja | JaKeinHinweis |{{#switch:

=Vorlage:Toter Link/Core{{#if: https://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/de/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/ [1] }} (Seite {{#switch:|no|0|=|dauerhaft }}nicht mehr abrufbar{{#if: | , festgestellt im {{#invoke:DateTime|format F Y}} }}. Suche im Internet Archive (T)){{#if: | Vorlage:Toter Link/archivebot }} 
         }}
(Seite {{#switch:|no|0|=|#default=dauerhaft }}nicht mehr abrufbar{{#if: | , festgestellt im {{#invoke:DateTime|format F Y}} }}.) 
     }}{{#switch:
0|= #default={{#if: }} 
    }}{{#invoke:TemplatePar|check
opt = inline= url= text= datum= date= archivebot= bot= botlauf= fix-attempted= checked= cat = Wikipedia:Vorlagenfehler/Vorlage:Toter Link errNS = 0 template = Vorlage:Toter Link format = preview = 1 
    }}{{#if: https://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/de/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/
isWebURL|https://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/de/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/}} {{#if: }} 
        }}
{{#if: {{#if: }} {{#if: }} 
        }}
    }}{{#if:
format noerror=1}} {{#if: }} 
         }}
    }}{{#switch: deadurl
deadurl|= #default= {{#if: }} 
    }}|#default= https://wiki-de.moshellshocker.dns64.de/index.php?title=Wikipedia:Defekte_Weblinks&dwl=https://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/de/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/ Die nachstehende Seite ist {{#switch:|no|0|=|dauerhaft }}nicht mehr abrufbar]{{#if:  | , festgestellt im {{#invoke:DateTime|format||F Y}} }}. (Suche im Internet Archive. (T).)  {{#if:
| Vorlage:Toter Link/archivebot }} 
         }}Vorlage:Toter Link/Core{{#switch:
0|= #default= {{#if: }} 
        }}{{#invoke:TemplatePar|check
all = inline= url= opt = datum= date= archivebot= bot= botlauf= fix-attempted= checked= cat = Wikipedia:Vorlagenfehler/Vorlage:Toter Link errNS = 0 template = Vorlage:Toter Link format = preview = 1 
       }}{{#if: https://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/de/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/
isWebURL|https://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/de/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/}} {{#if: }} 
        }}
    }}{{#if:
format noerror=1}} {{#if: }} 
           }}
    }}{{#switch: deadurl
deadurl|= #default= {{#if: }} 
    }}[https://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/de/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/ }}|{{#switch:
=Vorlage:Toter Link/Core{{#if: https://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/de/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/ [2] }} (Seite {{#switch:|no|0|=|dauerhaft }}nicht mehr abrufbar{{#if: | , festgestellt im {{#invoke:DateTime|format F Y}} }}. Suche im Internet Archive (T)){{#if: | Vorlage:Toter Link/archivebot }} 
         }}
(Seite {{#switch:|no|0|=|#default=dauerhaft }}nicht mehr abrufbar{{#if: | , festgestellt im {{#invoke:DateTime|format F Y}} }}.) 
     }}{{#switch:
0|= #default={{#if: }} 
    }}{{#invoke:TemplatePar|check
opt = inline= url= text= datum= date= archivebot= bot= botlauf= fix-attempted= checked= cat = Wikipedia:Vorlagenfehler/Vorlage:Toter Link errNS = 0 template = Vorlage:Toter Link format = preview = 1 
    }}{{#if: https://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/de/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/
isWebURL|https://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/de/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/}} {{#if: }} 
        }}
{{#if: {{#if: }} {{#if: }} 
        }}
    }}{{#if:
format noerror=1}} {{#if: }} 
         }}
    }}{{#switch:
deadurl|= #default= {{#if: }} 
    }}|#default= https://wiki-de.moshellshocker.dns64.de/index.php?title=Wikipedia:Defekte_Weblinks&dwl=https://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/de/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/ Die nachstehende Seite ist {{#switch:|no|0|=|dauerhaft }}nicht mehr abrufbar]{{#if:  | , festgestellt im {{#invoke:DateTime|format||F Y}} }}. (Suche im Internet Archive. (T).)  {{#if:
| Vorlage:Toter Link/archivebot }} 
         }}Vorlage:Toter Link/Core{{#switch:
0|= #default= {{#if: }} 
        }}{{#invoke:TemplatePar|check
all = inline= url= opt = datum= date= archivebot= bot= botlauf= fix-attempted= checked= cat = Wikipedia:Vorlagenfehler/Vorlage:Toter Link errNS = 0 template = Vorlage:Toter Link format = preview = 1 
       }}{{#if: https://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/de/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/
isWebURL|https://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/de/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/}} {{#if: }} 
        }}
    }}{{#if:
format noerror=1}} {{#if: }} 
           }}
    }}{{#switch:
deadurl|= #default= {{#if: }} 
    }}[https://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/de/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/ }} }}}}}}}}}}{{#if:|
        {{#invoke:Vorlage:Internetquelle|archivBot|stamp={{{archiv-bot}}}|text={{#if:https://web.archive.org/web/20150120024912/http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_17334/%7CVorlage:Webarchiv/archiv-bot}}

}}}}{{#invoke:TemplatePar|check

all= url= titel= opt= autor= hrsg= format= sprache= titelerg= werk= seiten= datum= abruf= zugriff= abruf-verborgen= archiv-url= archiv-datum= archiv-bot= kommentar= zitat= AT= CH= offline= 0 | Wikipedia:Vorlagenfehler/Vorlage:Internetquelle}} template= Vorlage:Internetquelle format=0 preview=1

}}</ref>

Beispiele

Beispiele für Liganden zur Proteinreinigung:

Ligand Zielprotein
Antigen,
Protein A, Protein G oder Protein L		 Antikörper
Substrat, Kofaktor Enzym
Ligand Rezeptor
Lectin Glykoprotein
Nukleinsäure Nukleinsäure bindendes Protein
Streptavidin, Avidin Biotin,
Protein mit Streptavidin-peptid
Metallionenchelat
wie Ni2+-NTA		 Protein mit Poly-histidin-peptid

Literatur

  • {{#invoke:Vorlage:Literatur|f}}
  • Jerker Porath et al. (1975): Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. In: Nature. Bd. 258, Nr. 5536, S. 598–599. PMID 1678

Einzelnachweise

<references />

Weblinks

Abgerufen von „https://wiki-de.moshellshocker.dns64.de/index.php?title=Affinitätschromatographie&oldid=233654“