imported>Ghilt: /* Proteintransfer */ klarer

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Proteintransfer: klarer

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[[Datei:Western Blot - Aufbau.svg|mini|Schematischer Aufbau einer Western Blot - Kammer mit markierter Anode und Kathode.]]
'''Western Blot''' ('''Westernblot''') bezeichnet die Übertragung (engl. ''[[Blotting]]'') von [[Protein]]en auf eine Träger[[Membran (Trennschicht)|membran]], die anschließend über immunologische<ref>{{Literatur |Autor=A. M. Gressner, O. A. Gressner |Titel=Western blot |Sammelwerk=Lexikon der Medizinischen Laboratoriumsdiagnostik |Verlag=Springer Berlin Heidelberg |Ort=Berlin, Heidelberg |Datum=2019 |ISBN=978-3-662-48985-7 |DOI=10.1007/978-3-662-48986-4_3674 |Seiten=2505–2506}}</ref> Reaktionen nachgewiesen werden können. Die Übertragung kann auf unterschiedliche Weise durchgeführt werden: mittels [[Diffusion]], [[Kapillarwirkung]] oder [[Elektrophorese]].<ref name="PMID26521711">A. Goldman, J. A. Ursitti, J. Mozdzanowski, D. W. Speicher: ''Electroblotting from Polyacrylamide Gels.'' In: ''Current protocols in protein science.'' Band 82, November 2015, S. 10.7.1–10.7.16, {{DOI|10.1002/0471140864.ps1007s82}}, PMID 26521711, {{PMC|4663689}}.</ref> Anwendung findet der Western Blot in der [[Biochemie|biochemischen]] und [[medizin]]ischen [[Forschung]] sowie in der [[Diagnostik]], wodurch er zu den meistverwendeten proteinanalytischen Methoden gezählt wird.<ref name=Moritz-2020>{{Cite journal|last=Moritz|first=CP.|date=2020-02-10|title=40 years Western blotting: A scientific birthday toast|pmid=31706026|journal=Journal of Proteomics|doi=10.1016/j.jprot.2019.103575}}</ref> Der Western Blot gehört zur Gruppe der [[Immunblot]]s.

== Geschichte ==
Die ''Western Blot''-Methode wurde ursprünglich 1979 im Labor von [[Robert Nowinski]] im [[Fred Hutchinson Cancer Research Center]] in [[Seattle]] von [[W. Neal Burnette]]<ref>Rajendrani Mukhopadhyay: [http://www.asbmb.org/asbmbtoday/asbmbtoday_article.aspx?id=15434 ''W. Neal Burnette: the man behind the Western Blot''], ASBMB Today 2012.</ref> und unabhängig im Labor von [[George R. Stark]] an der [[Stanford University|Universität Stanford]] entwickelt.<ref>Jaime Renart, Jakob Reiser, George E. Stark: ''Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.'' In: ''[[Proceedings of the National Academy of Sciences]].'' Bd. 76, Nr. 7, 1979, S. 3116–3120, PMID 91164, {{PMC|383774}}.</ref> Im selben Jahr konnten Harry Towbin und Mitarbeiter das Verfahren wie im einfacheren ''[[Southern Blot]]'' auf [[Nitrocellulose]] umstellen,<ref>Harry Towbin, Theophil Staehelin, Julian Gordon: ''Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.'' In: ''[[Proceedings of the National Academy of Sciences]].'' Bd. 76, Nr. 9, 1979, S. 4350–4354, PMID 388439, {{PMC|411572}}.</ref> was auch heutzutage die einfachere und präferierte Methode ist.

Die Bezeichnung des Blot-Verfahrens („Western Blot“) stammt vom englischen ''blot'' für Klecks oder Fleck und von engl. ''blotting paper'' für Löschpapier, bei dem auch ein identischer Abdruck des Originals entsteht. Diese wurde erstmals 1981 von Neal Burnette<ref>W. Neal Burnette: ''„Western blotting“: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.'' In: ''[[Analytical Biochemistry]].'' Bd. 112, Nr. 2, 1981, S. 195–203, PMID 6266278, {{DOI|10.1016/0003-2697(81)90281-5}}.</ref> als eine [[Allusion]] an ''[[Northern Blot]]'' und ''Southern Blot'' eingeführt (die Veröffentlichung erschien mit zwei Jahren Verspätung, da die Zeitschrift sie ursprünglich abgelehnt hatte).<ref>[http://www.garfield.library.upenn.edu/classics1991/A1991GK52400001.pdf Citation's Classic: W. Neal Burnette] (PDF; 234 kB)</ref> [[Edwin Southern]] gilt als der Erfinder der Blotting-Technik. Im Jahr 1975 entwickelte er eine Methode für die Auftrennung von [[Desoxyribonukleinsäure|DNA]]-Fragmenten und nachfolgende [[Hybridisierung (Molekularbiologie)|Hybridisierung]], die ihm zu Ehren als ''Southern Blot'' bezeichnet wurde. Die entsprechende Auftrennung von [[Ribonukleinsäure|RNA]]-Fragmenten wurde in Anlehnung an seinen Namen als ''Northern Blot'' bezeichnet. Daher nannte man das Proteinblotting mit [[Natriumlaurylsulfat|SDS]] ''Western Blot''. Zur Untersuchung von [[Protein-Protein-Interaktion]]en wurde der [[Far-Western-Blot]] entwickelt. Als Kombination des Western und des Southern Blot wurde zum Nachweis von [[DNA-Protein-Interaktion]]en der [[Southwestern Blot]] entwickelt, ebenso der [[Northwestern Blot]] zum Nachweis von RNA-Protein-Interaktionen.

Einen ''Eastern Blot'' ''per se'' gibt es nicht. Dennoch wird der Ausdruck „Eastern Blot“ für verschiedene Methoden in Anspruch genommen, z. B. für eine elektrophoretische Auftrennung und einen Transfer der Proteine auf Membranen mit einem kationischen [[Detergens]] (z. B. CTAB<ref>Engelbert Buxbaum: ''Cationic electrophoresis and electrotransfer of membrane glycoproteins.'' In: ''Analytical Biochemistry.'' Bd. 314, Nr. 1, 2003, S. 70–76, PMID 12633604, {{doi|10.1016/S0003-2697(02)00639-5}}.</ref><ref>Dianne T. Akin, Raymond Shapira, Joseph M. Kinkade Jr.: ''The determination of molecular weights of biologically active proteins by cetyltrimethylammonium bromide-polyacrylamide gel electrophoresis.'' In: ''Analytical Biochemistry.'' Bd. 145, Nr. 1, 1985, S. 170–176, PMID 4003759, {{doi|10.1016/0003-2697(85)90343-4}}.</ref> bei der [[CTAB-PAGE]] oder 16-BAC<ref>Joachim Hartinger, Katinka Stenius, Dagmar Högemann, [[Reinhard Jahn (Biologe)|Reinhard Jahn]]: ''16-BAC/SDS-PAGE: a two-dimensional gel electrophoresis system suitable for the separation of integral membrane Proteins.'' In: ''Analytical Biochemistry.'' Bd. 240, Nr. 1, 1996, S. 126–133, PMID 8811889, {{doi|10.1006/abio.1996.0339}}.</ref> bei der [[BAC-PAGE]]), bei dem die Proteine in die entgegengesetzte Richtung (zur Kathode) wandern. Der Ausdruck ''Eastern Blot'' wurde auch für das Blotten von Lipiden auf Membranen ([[Far-Eastern-Blot]]<ref name="Taki">Dai Ishikawa, Takao Taki: ''Micro-scale Analysis of Lipids by Far-eastern Blot (TLC Blot).'' In: ''Journal of Japan Oil Chemists' Society.'' 47, 1998, S. 963, {{DOI|10.5650/jos1996.47.963}}.</ref>), den Transfer nativer Proteine aus nichtdenaturierenden Gelen oder das Auftropfen (engl. {{lang|en|''Blotting''}}) von Molekülen verwendet.<ref>Hiroyuki Tanaka, Noriko Fukuda, Yukihiro Shoyama: ''Eastern blotting and immunoaffinity concentration using monoclonal antibody for ginseng saponins in the field of traditional chinese medicines.'' In: ''[[Journal of Agricultural and Food Chemistry]].'' Bd. 55, Nr. 10, S. 3783–3787, PMID 17455950, {{doi|10.1021/jf063457m}}.</ref>

== Prinzip ==

Vor dem eigentlichen Western Blot wird ein Proteingemisch mit Hilfe einer [[Gelelektrophorese|Gel-Elektrophoresetechnik]] in einer Trägermatrix ([[SDS-PAGE]], [[Nativ-PAGE]], [[isoelektrische Fokussierung]], [[2D-Gelelektrophorese]] usw.) entsprechend ihrer Größe, Ladung oder anderer Eigenschaften aufgetrennt. Hierbei werden die zu untersuchenden [[Proteine]] zuerst per [[Gelelektrophorese]] (in der Regel ein [[Polyacrylamid]]-Gel mit optimaler Acrylamid-Konzentration) in Proteinbanden aufgetrennt.

=== Proteintransfer ===
[[Datei:Semi-dry-blotter-06.jpg|mini|Semi-Dry-Blotter für den Elektrotransfer]]
[[Datei:Western blot wet transfer system Criterion-06.jpg|mini|Tank-Blotter für den Elektrotransfer]]
Beim Western Blot wird meistens ein senkrecht zum Polyacrylamid-Gel gerichtetes elektrisches Feld angelegt ''(Elektrotransfer)'', wodurch die mit SDS-beladenen und negativ geladenen Proteine in Richtung der [[Anode]] (Plus-Pol) wandern.<ref name="PMID 26521711">A. Goldman, J. A. Ursitti, J. Mozdzanowski, D. W. Speicher: ''Electroblotting from Polyacrylamide Gels.'' In: ''Current protocols in protein science / editorial board, John E. Coligan.. [et al.].'' Band 82, 2015, S. 10.7.1–10.7.16, {{DOI|10.1002/0471140864.ps1007s82}}, PMID 26521711.</ref> Sofern kein Zeitdruck besteht, kann der Transfer alternativ durch [[Kapillarwirkung]] in Richtung eines trockenen Stapels eines [[hydrophil]]en, [[Adsorption|adsorbierenden]] Materials erfolgen ''(Kapillartransfer)''<ref name="PMID 26521711" /> oder per [[Diffusion]].<ref>B. T. Kurien, R. H. Scofield: ''Multiple Immunoblots by Passive Diffusion of Proteins from a Single SDS-PAGE Gel.'' In: ''Methods in Molecular Biology.'' Band 1312, 2015, S. 77–86, {{DOI|10.1007/978-1-4939-2694-7_11}}, PMID 26043992.</ref>

Beim Transfer wandern die Proteine aus dem Gel auf eine Membran, z. B. [[Nitrocellulose]], [[Polyamide#Nylon|Nylon]], [[Glasfaser]] oder meistens Polyvinylidendifluorid ([[PVDF]]). PVDF-Membranen werden zuerst kurz in [[Methanol]] eingelegt, damit die [[Hydrophobie]] der Membran gemindert wird und der Transferpuffer in Kontakt mit der PVDF-Membran kommen kann. Bei Nylon oder PVDF bleiben Proteine aufgrund [[Hydrophobie|hydrophober]] und [[Polare Atombindung|polarer]] Wechselwirkungen an der Membranoberfläche haften, während die Adsorption bei Nitrocellulose oder Glasfasern über [[Chemische Bindung#Ionische Bindung|ionische]] und [[Polare Atombindung|polare]] Wechselwirkungen erfolgt.

Für einen Elektrotransfer wird die Membran anodenseitig auf das Gel gelegt und beidseitig mit Transferpuffer-benässten [[Filterpapier]]en belegt und zwischen die beiden [[Elektrode]]n gelegt. Für den Elektrotransfer werden drei unterschiedliche Systeme verwendet: das ''Tank-Blot''-System, das ''Semi-Dry-Blot''-System und das ''Dry-Blot''-System, die sich in Aufbau und eingesetzten Puffermengen und -systemen unterscheiden. Beim Elektrotransfer wird meistens ein [[elektrischer Strom]] von 2,5 [[Ampere|mA]]/cm² der Blotmembran verwendet, d. h. bei einer Blotmembran von 10 cm × 10 cm Größe werden im Elektrophorese-[[Netzteil]] 250 mA eingestellt. Daneben gibt es noch den Kapillartransfer ohne eine Verwendung von elektrischem Strom, bei dem das Gel auf ein Transferpuffer-benässtes Filterpapier gelegt, auf das wiederum die Membran und zuletzt ein trockener Filterpapierstapel gelegt wird.

Beim Transfer bleibt das Muster der elektrophoretischen Auftrennung erhalten. Die Proteine sind nun aber für weitere Methoden zugänglich (z. B. Bindung eines [[Immunkonjugat]]s). Nach diesem Vorgang kann das an den Proteinen angelagerte [[Natriumlaurylsulfat|SDS]] ausgewaschen werden. Daher können die Proteine [[renaturieren]] und teilweise ihre [[Sekundärstruktur|Sekundär-]] und [[Tertiärstruktur]] wieder einnehmen, aufgrund der räumlichen Trennung der verschiedenen Untereinheiten eines Proteins kann die [[Quartärstruktur]] so jedoch nicht wiederhergestellt werden. Zur Bestimmung der Anzahl und Größe der Untereinheiten eines Proteins kann jedoch vor der SDS-PAGE eine kovalente [[Vernetzung (Chemie)|Vernetzung]] der Untereinheiten durchgeführt werden, die ein Aufkochen in [[Probenpuffer]] für die SDS-PAGE übersteht und nach einer [[Immunfärbung]] den Aufbau eines [[Proteinkomplex]]es aufzeigen kann.

=== Proteindetektion ===
[[Datei:Ponceau Red & Coomassie Blue.jpg|mini|[[Ponceaurot]]-Färbelösung für Western Blot und [[Coomassie-Brillant-Blau]]-Färbelösung für [[SDS-PAGE]]]]
[[Datei:PonceauMembrane.png|miniatur|Blotmembran nach Proteintransfer und Ponceaufärbung aller Proteine. In der linken Spur ist ein vorgefärbter Proteinmarker aufgetrennt.]]
[[Datei:Amidoschwarz.svg|miniatur|Strukturformel von Amidoschwarz, dessen Natriumsalz [[Amidoschwarz 10 B]] als Farbstoff eingesetzt wird]]
Die temporäre Anfärbung aller Proteine auf der Blotmembran erlaubt eine Überprüfung des Proteintransfers und eine Abschätzung der Proteinmengen ''(Ladekontrolle)'' in den verschiedenen Spuren des Gels vor einer Immundetektion. Ursprünglich wurden zu diesem Zweck einzelne [[Haushaltsgen|Haushaltsproteine]] wie zum Beispiel [[Tubuline]] oder [[Aktin]]e sichtbar gemacht, jedoch weist die Anfärbung ''aller'' Proteine Vorteile auf.<ref name=Moritz-2017>{{Cite journal|last=Moritz|first=CP.|date=2017-09-20|title=Tubulin or not tubulin: Heading toward total protein staining as loading control in western blots|pmid=28941183|journal=Proteomics|doi=10.1002/pmic.201600189}}</ref> Die Gesamtheit der membrangebundenen Proteine kann über bestimmte Farbstoffe sichtbar gemacht werden. Beispiele sind [[Ponceau S]],<ref>Isabel Romero-Calvo, Borja Ocon, Patricia Martinez-Moya, Maria D. Suarez et al.: ''Reversible Ponceau staining as a loading control alternative to actin in Western blots.'' In: ''Analytical Biochemistry.'' Bd. 401, 2010, S. 318–320, PMID 20206115.</ref> [[kolloidales Gold]], [[Amidoschwarz]]<ref>Fabrizio Gentile, Ernesto Bali, Giuseppe Pignalosa: ''Sensitivity and applications of the nondenaturing staining of proteins on polyvinylidene difluoride membranes with Amido black 10B in water followed by destaining in water.'' In: ''Analytical Biochemistry.'' Bd. 245, 1997, S. 260–262, PMID 9056225</ref> oder [[Tusche]]. Andere Farbstoffe sind in der Lage, [[posttranslationale Modifikation]]en wie z. B. [[Phosphorylierung|phosphorylierte]] Proteine zu markieren. Die bei der SDS-PAGE häufig verwendeten Färbungen wie die [[Coomassie-Brillant-Blau|Coomassie]]-Färbung oder die [[Silberfärbung]] erlauben nur eine geringe Renaturierung der Proteine während der Entfärbung vor einer Immundetektion und entfärben zudem unvollständig.<ref>Charlotte Welinder, Lars Ekblad: ''Coomassie staining as loading control in Western blot analysis.'' In: ''Journal of Proteome Research'' Bd. 10, 2011, S. 1416–1419, PMID 21186791.</ref> Fluoreszente Färbungen besitzen in zweidimensionalen Anwendungen einen größeren linearen dynamischen Bereich und erlauben eine genauere Mengenbestimmung, wie z. B. die [[Proteinfärbung|Gesamtproteinfärbungen]] mit Trichloroethanol<ref>Carol L. Ladner, Jing Yang, Raymond J. Turner, Robert A. Edwards: ''Visible fluorescent detection of proteins in polyacrylamide gels without staining.'' In: ''Analytical Biochemistry'' Bd. 326, 2004, S. 13–20, PMID 14769330.</ref><ref>Jennifer E. Gilda, Aldrin V. Gomes: ''Stain-Free total protein staining is a superior loading control to β-actin for Western blots.'' In: ''Analytical Biochemistry'' Bd. 440, 2013, S. 186–188, PMID 23747530.</ref> oder [[Epicocconon]].<ref>Christian P. Moritz, Sabrina X. Marz, Ralph Reiss, Thomas Schulenborg, Eckhard Friauf: ''Epicocconone staining: a powerful loading control for Western blots.'' In: ''Proteomics'' PMID 24339236.</ref> Je nach Versuchsaufbau können auch mit anderen Methoden selektiv einzelne Proteine sichtbar gemacht werden, z. B. [[radioaktiv]] markierte Antikörper oder andere Proteine, die durch den Einbau von [[Isotop]]en bei der [[Proteinbiosynthese|Proteinsynthese]] oder durch nachträgliche [[Phosphorylierung]] radioaktiv markiert werden, bei [[Enzym]]en durch Umsetzen eines entsprechenden [[Substrat (Biochemie)|Substrats]].

Wurde zusätzlich zu den zu untersuchenden Proteinen ein ungefärbter Größenmarker (synonym: [[Komigrationsstandard]]) verwendet, sollte zuerst eine reversible Färbung aller Proteine auf der Membran mit z. B. Ponceau S erfolgen. Die anschließend sichtbaren Markerbanden können mit mechanischem Druck auf die Membran erhalten werden und so auch noch nach der Farbreaktion zur Proteinidentifizierung herangezogen werden. Bei vorgefärbten Größenmarkern entfällt die reversible Proteinfärbung.

=== Blockierung ===
Nach dem Proteintransfer werden die verbliebenen freien Stellen für eine Proteinbindung auf der Membran mit einem für die Antikörper nicht erkennbaren Protein oder chemischen [[Polymer]] blockiert. Dadurch können anschließend keine weiteren, unerwünschten Proteine an der Membran haften und in der Antikörperfärbung unerwünschte Färbungen erzeugen. Dafür eignen sich Lösungen von entfettetem [[Milchpulver]], Rinderserumalbumin ([[Bovines Serumalbumin|BSA]], bovine serum albumin), [[Gelatine]] und andere Proteine oder auch Lösungen von [[Polyvinylpyrrolidon]] mit einem milden Detergens (wie z. B. [[Polysorbate|Tween 20]] oder [[Octoxinol 9|Nonidet P40]]).<ref>John W. Haycock: ''Polyvinylpyrrolidone as a blocking agent in immunochemical studies.'' In: ''Analytical Biochemistry.'' Bd. 208, Nr. 2, 1993, S. 397–399, PMID 8095775, {{doi|10.1006/abio.1993.1068}}.</ref><ref>Klaus Klarskov, Stephen Naylor: ''India ink staining after sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis and in conjunction with Western blots for peptide mapping by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.'' In: ''Rapid Communications in Mass Spectrometry.'' Bd. 16, Nr. 1, 2002, {{ISSN|0951-4198}}, S. 35–42, PMID 11754245, {{doi|10.1002/rcm.522}}.</ref>

=== Immundetektion einzelner Proteine ===
[[Datei:Schema der Immundetektion.jpg|miniatur|Schema der Immundetektion. Der primäre Antikörper bindet an sein Antigen, welches auf der Blotmembran fixiert ist. An diesen wiederum bindet der sekundäre Antikörper zum Nachweis]]
[[Datei:Westernblot1a.png|miniatur|Westernblot einer [[Zellulosenitrat|Nitrozellulosemembran]] mit einem Protein in unterschiedlichen Mengen (von links: 17 ng, 13 ng, 11 ng, 8 ng, 4 ng), der Nachweis erfolgte per Chemolumineszenz (ECL) auf [[Röntgenfilm]]]]
[[Datei:Anti-lipoic acid immunoblot.png|miniatur|Western Blot mit fluoreszenzmarkiertem Sekundärantikörper]]
{{Hauptartikel|Immunmarkierung}}
Die Proteinbanden einzelner Proteine werden meistens auf der Membran mit Hilfe spezifischer [[Antikörper]] identifiziert, die an einzelne [[Epitop]]e im gesuchten Protein binden. Durch Einlegen der proteinbeladenen Blotmembran in verdünnte Lösungen von spezifischen Antikörpern ([[Monoklonaler Antikörper|monoklonal]]) oder von Mischungen von spezifischen Antikörpern ([[Polyklonaler Antikörper|polyklonal]]) binden die Antikörper an der passenden Proteinbande auf der Membran. Dieser direkt ans Protein bindende Antikörper wird als Primärantikörper bezeichnet. Unspezifisch gebundene Antikörper werden aufgrund von Waschschritten mit [[Puffer (Chemie)|Puffern]] (meistens dreimal für je 10 Minuten mit [[TBS-T-Puffer]]), die [[Detergens|Detergentien]] enthalten, wieder entfernt. Dabei macht man sich die [[Affinität (Biochemie)|Affinität]] der Bindung zwischen [[Antigen]] und Antikörper zunutze: Ein antigenspezifischer Primärantikörper bindet nur an „sein“ Epitop auf dem räumlich von den anderen Proteinen getrennten Antigen mit einer charakteristischen [[Molmasse]]. Weil die Renaturierung oftmals nicht vollständig ist, können bei der Verwendung monoklonaler Antikörper, die ein diskontinuierliches Epitop (synonym: Konformationsepitop) am Protein erkennen, Probleme auftreten. Mit Antikörpern, die ein kontinuierliches Epitop (synonym: Sequenzepitop) erkennen können, ist eine Renaturierung nicht erforderlich.

Die Detektion erfolgt meistens mit einem [[Immunkonjugat]], bestehend aus einem signalbildenden Molekül, gekoppelt an einen weiteren Antikörper (Sekundärantikörper). An die [[Fc-Fragment|Fc-Region]] des primären Antikörpers bindet ein sekundärer Antikörper als Antikörperkonjugat (Immunkonjugat) mit einem [[Reporterenzym]], über das nach weiteren Waschschritten (meistens dreimal für je 10 Minuten mit TBS-T-Puffer) die Detektion erfolgt. Die Verwendung eines Sekundärantikörper-Konjugats anstelle eines Primärantikörper-Konjugats erlaubt dessen modulare Verwendung bei verschiedenen Primärantikörpern mit einhergehender Kostenersparnis, da die Kopplung jedes einzelnen Primärantikörpers mit einem Reporterenzym entfällt. Weiterhin kommt es durch den Sekundärantikörper zur Signalverstärkung, da der polyklonale, gegen mehrere Epitope auf dem Fc-Fragment einer [[Art (Biologie)|Spezies]] gerichtete Sekundärantikörper an mehrere Stellen im Fc-Bereich aller Primärantikörper einer Art binden kann und dort viele Reporterenzyme gruppiert. Reporterenzym-Antikörperkonjugate (-Immunkonjugate) sind im Handel erhältlich. Bei Enzym-gekoppelten Immunkonjugaten wird durch das Enzym eine [[Farbstoff|Farb-]] oder [[Chemolumineszenz]]reaktion (ECL) katalysiert, z. B. mit einem [[Meerrettichperoxidase|HRP]]-gekoppelten Sekundärantikörper. HRP katalysiert die Umsetzung von [[Luminol]] oder anderen [[Dioxetane]]n in seine oxidierte Form, dessen [[Lumineszenz]] detektiert werden kann. Die Lumineszenzreaktion erfolgt z. B. in einer Lösung von 100 mM [[TRIS]]/HCl pH 6,8; 0,2 mM [[P-Cumarsäure|''p''-Cumarsäure]] (in [[Dimethylsulfoxid]] gelöst); 1,2 mM Luminol (Natriumsalz, in Dimethylsulfoxid gelöst) und 0,01 % (V/V) [[Wasserstoffperoxid]].

Je nach Fragestellung kann beim Immunblot – wie unten beschrieben – das Antigen oder – wie z. B. beim [[HIV-Test]] – auch der Primärantikörper das Suchobjekt sein. Auch Antikörper sind Proteine, und daher kann man ihre [[antigen]]en Eigenschaften neben dem Western Blot auch z. B. im Immunblot, [[ELISPOT]] und [[ELISA]] sichtbar machen.

== Immunblot vs. (EL)ISA ==
Beides sind Methoden, die zum Nachweis von Antigenen (Proteinen) mit Hilfe markierter Antikörper dienen: Beide sind damit ISAs ('''I'''mmuno'''s'''orbent '''A'''ssay), Methoden aus dem Bereich der [[Proteomik]].

Der Immunblot erweitert den [[ELISA]] gewissermaßen um die Dimension der elektrophoretischen Auftrennung auf Kosten einer selektiven Anreicherung der Antigene durch ''Coating''-Antikörper. Diese fehlende Anreicherung kann durch eine zusätzliche [[Proteinreinigung]] oder eine [[Immunpräzipitation]] erreicht werden. Auch ist der Western Blot weniger für eine quantitative Bestimmung geeignet als der ELISA. Durch die [[Gelelektrophorese]] und die Fixierung auf einem Festmedium (der Blotmembran) stehen den Antikörpern an verschiedenen, definierten Orten unterschiedliche Antigene getrennt zur „Auswahl“: Ein einziger Immunblot kann z. B. ein [[Immunserum|Serum]] mittels einer Vielzahl aufgeblotteter Antigene auf ebendiese Vielzahl an zugehörigen Antikörpern überprüfen, jedoch werden aufgrund der [[Denaturierung (Biochemie)|Denaturierung]] während der Probenvorbereitung zur SDS-PAGE fast ausschließlich kontinuierliche Epitope (synonym Sequenzepitope) nachgewiesen. Durch die räumliche Auftrennung können ebenso mehrere Bestandteile, gegen die ein Serum Antikörper enthält, parallel und selektiv nachgewiesen werden. Dieser Effekt kann durch Seren von Immunisierten oder Rekonvaleszenten (polyklonal) oder auch durch Mischungen von [[monoklonaler Antikörper|monoklonalen]] Antikörpern erreicht werden.

== Anwendungen ==
Der Western Blot gehört zu den am weitesten verbreiteten proteinanalytischen Methoden. Schätzungsweise verwenden mindestens 8–9 % der derzeit in diesem Feld veröffentlichten Arbeiten Western Blots.<ref name=Moritz-2020/> Im Bereich der [[Proteinbiochemie]] dient der Western Blot zum qualitativen Nachweis von einzelnen Proteinen und Protein-Veränderungen wie eine [[posttranslationale Modifikation]]. Es kann auch eine [[Schätzung|semiquantitative]] Analyse durchgeführt werden (Probe A enthält mehr Protein X als Probe B), und mit dem Auftrag einer [[Verdünnungsreihe]] einer bekannten Proteinkonzentration kann die Abschätzung der Menge eines einzelnen Proteins auf dem Blot etwas genauer verglichen werden. Bei einer [[Klonierung]] eines [[Vektor (Gentechnik)|Vektors]] zur Herstellung von [[Rekombinantes Protein|rekombinanten Proteinen]] wird der Western Blot nach einer [[Transfektion]] von eukaryotischen Zellen und ungefähr zweitägiger [[Zellkultur]] oder nach einer [[Transformation (Genetik)|Transformation]] von [[Bakterien]] und etwa eintägiger Kultur zur Überprüfung der [[Proteinbiosynthese]] des jeweiligen Proteins verwendet.

Im Bereich der Medizin dient das Western Blotting dem Nachweis diagnostisch relevanter Proteine, so zum Beispiel von Antikörpern im [[Blutserum]], welche für das Vorliegen bestimmter [[Infektionskrankheit]]en typisch sein können, z. B. beim [[HIV-Test]]. Außerdem hilft diese Methode in der Forschung bei der Suche nach krankheitsrelevanten Proteinen wie z. B. dem [[BSE]]-Erreger [[PrPSc]] oder das [[HIV]]. Auch verschiedene Proteine wie die [[Extracellular-signal Regulated Kinase|ERK]], die gehäuft in [[Tumor]]en vorkommen, können über Western Blot quantifiziert und entartete Zellen hierdurch erkannt werden. Auch kann z. B. bestimmt werden, inwiefern sich bestimmte Medikamente regulativ auf die vermehrte Expression solcher Proteine in der Zelle auswirken und somit eine Wirksamkeit gegen das weitere Wachstum der Tumorzellen haben.

== Literatur ==
* [[Friedrich Lottspeich]], Haralabos Zorbas (Hrsg.): ''Bioanalytik.'' Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg u. a. 1998, ISBN 3-8274-0041-4.
* [[Hubert Rehm]], Thomas Letzel: ''[[Der Experimentator]]: Proteinbiochemie / Proteomics.'' 6. Auflage, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2010, ISBN 978-3-8274-2312-2.

== Weblinks ==
* {{Webarchiv |url=http://www.antikoerper-online.de/resources/17/622/Western+Blot+Hintergrundinformationen/ |wayback=20111206072209 |text=Western Blot: Hintergrundinformationen}}
* [https://www.laborjournal.de/rubric/tricks/tricks/m_trick81.php Erstellen der eigenen Chemolumineszenzlösung (Luminol) für Western Blots] (in Laborjournal vom 10. Juni 2005)

== Siehe auch ==
* [[Northern Blot]]
* [[Reverser Northern Blot]]
* [[Northwestern Blot]]
* [[Southwestern Blot]]
* [[Southern Blot]]
* [[Far-Western-Blot]]
* [[Microarray]]

== Einzelnachweise ==
<references />

[[Kategorie:Elektrophorese]]
[[Kategorie:Immunchemisches Testverfahren]]
[[Kategorie:Virologische Diagnostik]]
[[Kategorie:Protein-Methode]]
[[Kategorie:Molekularbiologie]]
[[Kategorie:Biochemisches Nachweisverfahren]]

Western Blot - Versionsgeschichte

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