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2021-01-21T12:32:36Z

Verfahren und Effekte

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Der Begriff '''Vektordesign''' bezeichnet in der [[Gentechnik]] die gezielte Anpassung eines [[Vektor (Gentechnik)|Vektors]] (im allgemeinen Sinn) mit [[Molekularbiologie|molekularbiologischen]] Methoden zur Vervielfältigung von [[Desoxyribonukleinsäure|DNA]]. So wurde schon 1977 das [[Plasmid]] [[pBR322]] aus einem natürlich vorkommenden Plasmid entwickelt. In der Folge wurde dieses und andere Plasmide im Zuge des Vektordesigns verkleinert und mit neuen [[Antibiotikaresistenz|Antibiotikaresistenzen]] und [[Replikationsursprung|Replikationsursprüngen]] versehen. Der am häufigsten modifizierte Abschnitt umfasst die Klonierungsstelle, häufig ein Bereich in dem viele nur einmal im Plasmid vorkommende (''unique'') [[Restriktionsenzym]]-Erkennungsstellen liegen, der multiplen Klonierungsstelle (''mcs'', ''multiple cloning site''), auch [[Polylinker]] genannt. Sie dient dem gezielten Einbau von DNA Molekülen, mit dem Ziel der Vervielfältigung (Amplifikation) von Fremd-DNA. Zur Erzeugung [[Überexpression|rekombinanter]] [[Protein|Proteine]], codierender oder [[Nichtcodierende Ribonukleinsäure|nichtcodierender Ribonukleinsäuren]] und ihrer ''[[in vitro]]'' oder ''[[in vivo]]'' Anwendung werden geeignete flankierende Regulationsstellen inseriert.
Dies erfolgt beispielsweise zu transienten Zwecken wie bei [[Impfstoff]]en (z. B. transiente [[Viraler Vektor|virale Vektoren]] oder [[DNA-Impfung|DNA-Impfstoffe]]), der transienten [[Transfektion]] oder bei [[onkolytische Viren|onkolytischen Viren]] sowie zu permanenten Zwecken wie der [[Gentherapie]] oder der Erzeugung von [[gentechnisch veränderter Organismus|gentechnisch veränderten Organismen]].

Der [[Organismus]] oder [[Zelltyp]] bei der Herstellung ist nicht notwendigerweise auch der Zielorganismus des Vektors (engl. ''{{lang|en|shuttle vector}}'' ‚Pendelvektor‘, z. B. [[Plasmid]]e mit [[eukaryotisch]]en [[Expressionskassette]]n, virale Vektoren zur Verpackung in [[Zellkultur]]en). Oftmals werden daher Anpassungen an beide Arten von [[Wirt (Biologie)|Wirten]] vorgenommen.

== Verfahren und Effekte ==
Zur Steigerung der [[Genexpression]] werden auch die DNA-Abschnitte außerhalb der proteincodierenden Sequenz verändert. Die Wahl des [[Promotor (Genetik)|Promotors]], [[Enhancer (Genetik)|Enhancers]] und [[Terminator (Genetik)|Terminators]] kann die Expressionsmenge steigern,<ref>J. Y. Qin, L. Zhang, K. L. Clift, I. Hulur, A. P. Xiang, B. Z. Ren, B. T. Lahn: Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter. In: ''[[PLOS ONE]].'' 2010, Band 5, Nr. 5, Artikel e10611, PMID 20485554, {{PMC|2868906}}.</ref><ref>J. Blazeck, H. S. Alper: ''Promoter engineering: Recent advances in controlling transcription at the most fundamental level.'' In: ''Biotechnology Journal.'' 2012, {{DOI|10.1002/biot.201200120}}, PMID 22890821.</ref> sofern sie in der zur Proteinexpression eingesetzten Spezies verwendet werden können. Dabei gibt es deutliche Unterschiede zwischen Säugern, Bakterien und Archaeen.<ref>Z. L. Xu, H. Mizuguchi, A. Ishii-Watabe, E. Uchida, T. Mayumi, T. Hayakawa: ''Strength evaluation of transcriptional regulatory elements for transgene expression by adenovirus vector.'' In: ''[[Journal of Controlled Release]].'' 2002, Band 81, Nr. 1-2, S. 155–63, PMID 11992688.</ref><ref>J. C. Samuelson: ''Recent developments in difficult protein expression: a guide to E. coli strains, promoters, and relevant host mutations.'' In: ''Methods in Molecular Biology.'' 2011, Band 705, S. 195–209, PMID 21125387.</ref><ref>S. Berkner, G. Lipps: ''Genetic tools for Sulfolobus spp.: vectors and first applications.'' In: ''Archives of Microbiology.'' 2008, Band 190, Nr. 3, S. 217–30, PMID 18542925.</ref> Ebenso richtet sich das Vektordesign nach der Verwendung als [[Klonierungsvektor]] oder als [[Expressionsvektor]].

Kernexportsequenzen können bei [[Eukaryot]]en die RNA-Konzentration im [[Zytosol]] und somit die Expressionsmenge durch das dortige [[Ribosom]] erhöhen.<ref>J. E. Donello, J. E. Loeb, T. J. Hope: ''Woodchuck hepatitis virus contains a tripartite posttranscriptional regulatory element.'' In: ''Journal of Virology.'' 1998, Band 72, Nr. 6, S. 5085–92, PMID 9573279, {{PMC|110072}}.</ref> Weiterhin kann durch eine [[Kozak-Sequenz]] die Erkennung der [[mRNA]] am Ribosom verbessert werden.<ref>M. Kozak: ''An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs.'' In: ''[[Nucleic Acids Research]].'' 1987, Band 15, Nr. 20, S. 8125–48, PMID 3313277, {{PMC|306349}}.</ref> Durch ein [[Polyadenylierung]]ssignal sowie durch die Vermeidung von AUUUA-Sequenzen am 3'-Ende kann der vorzeitige Abbau der mRNA gemindert werden.<ref>T. Hamilton, M. Novotny, P. J. Jr. Pavicic, T. Herjan, J. Hartupee, D. Sun, C. Zhao, S. Datta: ''Diversity in post-transcriptional control of neutrophil chemoattractant cytokine gene expression.'' In: ''Cytokine.'' 2010, Band 52, Nr. 1-2, S. 116–22, PMID 20430641, {{PMC|2919655}}.</ref> Die modulare Eigenschaft des Polylinkers kann durch eine [[Insertion (Genetik)|Insertion]] oder [[Deletion]] einer Erkennungssequenz für [[Restriktionsenzym]]e modifiziert werden. Gelegentlich werden modular austauschbare Expressionskassetten verwendet, die einen Austausch durch [[homologe Rekombination]] oder durch das [[RMCE-Kassettenaustauschverfahren]] erlauben. Bei einer Expression mehrerer Proteine können mehrere Vektoren, mehrere [[Operon]]s in einem Vektor, [[IRES (Biologie)|IRES]], [[Intein]]e oder [[2A-Peptide]] verwendet werden.

Die [[Replikation]] eines Plasmidvektors kann durch Einfügen eines oder mehrerer Replikationsursprünge und eventuell notwendiger [[Centromer]]e auf mehrere Arten erweitert werden, wodurch bei Plasmiden eine längerfristige Expression erreicht werden kann, z. B. bei Plasmiden in Säugerzellen.

Die Veränderung der Protein-codierenden Sequenz wird meistens parallel zum Vektordesign durchgeführt. Im Zuge eines ''Proteindesigns'' können z. B. durch eine ''[[Codon]]-Optimierung'' der [[Expressionskassette]] die Expressionsrate gesteigert oder andere Eigenschaften verändert werden.<ref>E. Kotsopoulou, V. N. Kim, A. J. Kingsman, S. M. Kingsman, K. A. Mitrophanous: ''A Rev-independent human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-based vector that exploits a codon-optimized HIV-1 gag-pol gene.'' In: ''[[Journal of Virology]].'' 2000, Band 74, Nr. 10, S. 4839–4852, PMID 10775623, {{PMC|112007}}.</ref>
{{Hauptartikel|Proteindesign}}

== Vektorsicherheit ==
Eine maßgebliche Anforderung an einen Vektor ist die Sicherheit seiner Anwendung in Lebewesen, die in Bezug auf den Menschen durch die [[biologische Schutzstufe]] gekennzeichnet wird. Die Einteilung der Schutzstufe betrachtet die [[Pathogenität]], welche unter anderem durch die Möglichkeit einer [[Replikation]], einer permanenten [[Transgen|Veränderung des Genoms]] (die Insertion begünstigt eine [[Tumor]]entstehung), sowie durch die [[Infektiosität]] und die [[Symptomatik]] bestimmt wird.

Zur Vermeidung einer überschießenden [[Immunreaktion]] werden bei bakteriell erzeugten Vektoren herstellungsbedingte [[Pyrogen]]e untersucht. Ebenso dürfen bei [[Plasmid]]en die [[Antibiotikum-Resistenz]]-vermittelnden [[Resistenzgen]]e, welche bei der Herstellung zur [[Selektion (Evolution)|Selektion]] verwendet werden, nicht auf die [[Mikroorganismen]] übertragen werden (z. B. [[Hautflora]], [[Mundflora]] und [[Darmflora]]). Daher werden alternativ [[Auxotrophie]]n zur Selektion der transgenen Organismen verwendet oder die Resistenzgene nachträglich entfernt.

Bei [[viraler Vektor|viralen Vektoren]] werden einige zur [[Replikation]] notwendige [[Gen]]e per [[Deletion]] entfernt, so dass eine Erzeugung nur durch [[Komplementation]] in einer [[Zelllinie]] erfolgen kann, die diese Gene zuvor erhalten hat. Dies wird als Replikationsdefizienz bezeichnet. Ebenso kann durch eine Veränderung des [[Rezeptor (Biochemie)|Rezeptor]]s der [[Tropismus (Virologie)|Tropismus]] im Zuge einer [[Pseudotypisierung]] eingeschränkt oder geändert werden. Durch die Verwendung [[Zelltyp]]-spezifischer Promotoren kann eine lokale Eingrenzung der [[Genexpression]] erreicht werden.

Vor der Entwicklung gentechnischer Methoden wurde eine Erhöhung der Sicherheit eines [[Viren|Virus]] durch [[Attenuierung]] erreicht. Diese [[Lebendimpfstoff]]e umfassen z. B. die Schluckimpfung gegen [[Poliomyelitis]] oder die auf dem [[Vacciniavirus]] basierenden [[Pocken]]impfstoffe, [[Modified-Vaccinia-Ankara-Virus|MVA]] und NYVAC.

== Literatur ==
* Cornel Mülhardt: ''Der Experimentator: Molekularbiologie/Genomics.'' 6. Auflage. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2008, ISBN 978-3-8274-2036-7.
* [[Friedrich Lottspeich]], Haralabos Zorbas: ''Bioanalytik''. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 1998. ISBN 3-8274-0041-4.
* [[Hubert Rehm]], Thomas Letzel: ''Der Experimentator: Proteinbiochemie / Proteomics''. 6. Auflage, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2009. ISBN 978-3-8274-2312-2.

== Einzelnachweise ==
<references />

[[Kategorie:Molekularbiologie]]
[[Kategorie:Gentechnik]]
[[Kategorie:Biochemische Methode]]

Vektordesign - Versionsgeschichte

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