imported>Aka: /* TAP-Tag */ falsches Komma entfernt, Kleinkram

2024-11-15T17:18:37Z

TAP-Tag: falsches Komma entfernt, Kleinkram

Neue Seite

[[Datei:Schematic depiction of two affinity purification approaches..jpg|mini|Schema der ''Tandem Affinity Purification'']]
Die '''Tandem Affinity Purification''' (TAP) beschreibt die [[Proteinreinigung]] unter Verwendung zweier verschiedener chromatographischer Aufreinigungsmethoden. Bei einer Verwendung zweier verschiedener [[Protein-Tag]]s können beispielsweise zwei verschiedene [[Affinitätschromatographie]]n durchgeführt werden.<ref>J. T. Kadonaga, R. Tjian: ''Affinity purification of sequence-specific DNA binding proteins.'' In: ''Proc Natl Acad Sci U S A'' (1986), Band 83(16), S. 5889–5893. PMID 3461465; {{PMC|386402}}.</ref> Im erweiterten Sinne umfasst die ''Tandem Affinity Purification'' alle seriellen Aufreinigungsverfahren, die auf der [[Affinität (Biochemie)|Affinität]] des aufzureinigenden Materials zur [[stationäre Phase|stationären Phase]] beruhen.<ref>M. de Frutos, F. E. Regnier: ''Tandem chromatographic-immunological analyses.'' In: ''Anal Chem.'' (1993), Band 65(1), S. 17A–25A. PMID 8420386.</ref>

== TAP-Tag ==
Ab dem Jahr 1999 wurden ''Tandem Affinity Purification Tags'' für Proteine entwickelt, welche aus zwei verschiedenen, aufeinander folgenden Protein-Tags bestehen.<ref name="rigautgetal">{{cite journal| author=G. Rigaut et al.| title=A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration|journal=Nature Biotechnology|date=1999| volume=17|pmid=10504710| pages=1030–1032| doi=10.1038/13732| issue=10}}</ref><ref name="puigoetal">{{cite journal| author=O. Puig et al.| title=The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification|journal=Methods|date=2001| volume=24|pmid=11403571| pages= 218–229| doi=10.1006/meth.2001.1183| issue=3}}</ref> Dessen äußeres ([[N-Terminus|''N-'']] oder [[C-Terminus|''C-''terminales]]) Protein-Tag wird in der ersten Säule nach Entfernung unerwünschter Bestandteile aus dem [[Zellaufschluss]] durch die [[Protease]] ''TEV'' gespalten, wodurch das gewünschte Protein (ohne sein äußeres Protein-Tag), die TEV-Protease und einige restliche [[Kontamination (Medizin)|Kontamination]]en von der Chromatographiesäule [[eluieren]]. Die TEV-Protease aus dem ''Tobacco Etch Virus'' hat eine längere Erkennungssequenz (Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser) bzw. ENLYFQ(G/S)), um das aufzureinigende Protein nicht an anderen Stellen zu zerschneiden. Meistens wird zur Entfernung der TEV-Protease und restlicher Kontaminationen als zweites, innenliegendes Protein-Tag das [[Calmodulin|CaM]]-Tag oder ein [[Biotin]]-basiertes Tag verwendet, da deren Elutionsbedingungen nicht [[Denaturierung (Biochemie)|denaturierend]] sind und die Bestandteile des Elutionspuffers ([[Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraessigsäure|EGTA]] bzw. Biotin) wenig bei einer folgenden Verwendung stören.

Die Wahl des TAP-Tags und das N- oder C-terminale Einfügen wird durch den Erhalt der biologischen Aktivität des Proteins bestimmt, da manche Kombinationen zu einer fehlerhaften [[Proteinfaltung]] und somit geminderter Funktion führen können.<ref>O. Puig, F. Caspary, G. Rigaut, B. Rutz, E. Bouveret, E. Bragado-Nilsson, M. Wilm, B. Séraphin: ''The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.'' In: ''Methods'' (2001), Band 24(3), S. 218–229, PMID 11403571.</ref><ref>A. C. Gavin, P. Aloy, P. Grandi, R. Krause et al.: ''Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery.'' In: ''Nature'' (2006), Band 440, S. 631–636, PMID 16429126.</ref> Daher wird der Einfluss der Position des TAP-Tags auf die Funktion des [[Fusionsprotein]]s experimentell bestimmt.

Nachdem nur wenige Kombinationen hohe Proteinmengen und [[Ausbeute (Chemie)|Ausbeuten]] der Proteinreinigung erlauben,<ref name="PMID21424840">Y. Li: ''The tandem affinity purification technology: an overview.'' In: ''Biotechnol Lett.'' (2011), Band 33(8), S. 1487–1499, PMID 21424840.</ref> werden heute vereinzelte Kombinationen eingesetzt, z. B. das [[SBP-Tag|SBP]]-CBP-Tag (''InterPlay''), das [[FLAG-Tag|FLAG]]-HA-Tag, das 3xFLAG-[[His-Tag]], das ProtA-ProtC-Tag, das ProtG-SBP-Tag, das 2xFLAG-ProtA-Tag, das His-2x[[Strep-tag|StrepII-Tag]], das SBP-HA-Tag und das SBP-His-Tag.<ref name="PMID21424840" />

== Anwendungen ==
Die Tandem Affinity Purification wird unter anderem zur Reduktion der Reinigungsschritte bei der Proteinreinigung eingesetzt. In Kombination mit der [[Massenspektrometrie]] oder mit einem [[Western Blot]] können Proteine identifiziert und [[Protein-Protein-Interaktion]]en längerer Verweildauer nachgewiesen werden.

== Literatur ==
* [[Hubert Rehm]], Thomas Letzel: ''Der Experimentator: Proteinbiochemie / Proteomics''. 6. Auflage, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2009. ISBN 978-3-8274-2312-2.

== Einzelnachweise ==
<references />

[[Kategorie:Protein-Methode]]
[[Kategorie:Biochemisches Trennverfahren]]

Tandem Affinity Purification - Versionsgeschichte

imported>Aka: /* TAP-Tag */ falsches Komma entfernt, Kleinkram