imported>Drahreg01: Wikilink, Artikel folgt.

2023-04-02T19:38:23Z

Wikilink, Artikel folgt.

Neue Seite

Ein '''SNAP-Tag''' ist ein [[Protein-Tag]], das es ermöglicht, ein [[Protein]] in Zellen einer [[Zellkultur]] spezifisch mit einem [[Fluoreszenz]]farbstoff mit hoher [[Quantenausbeute]] zu markieren.

== Eigenschaften ==
Standardmäßig werden Untersuchungen heutzutage mit Protein-Tags, beispielsweise fluoreszierenden Proteinen durchgeführt, wie z. B. [[Grün fluoreszierendes Protein|GFP]] (green fluorescent protein) oder [[YFP]] (yellow fluorescent protein). Die Methoden sind zwar verhältnismäßig leicht durchzuführen, weil die zugrundeliegenden Techniken mittlerweile sehr gut etabliert sind (Bildung von [[Fusionsprotein]]en und gezielte [[Überexpression|Expression]] in lebenden Zellen); auf der anderen Seite sind die photophysikalischen Eigenschaften der Proteine in der Regel nicht geeignet, um damit [[Einzelmolekülspektroskopie]] zu betreiben. Sie weisen im Vergleich zu kommerziell erhältlichen Farbstoffen eine sehr viel niedrigere Fluoreszenzquantenausbeute auf und werden durch Anregung mit einem fokussierten Laserstrahl im Zuge eines [[Photobleichung|Photobleachings]] in der Regel schnell zerstört.

Das sogenannte SNAP-Protein ist ein Derivat eines in Säugetierzellen ubiquitären [[Enzym]]s, der ''O''-6-Alkylguaninalkyltransferase (AGT), die üblicherweise im Organismus die Aufgabe hat, [[DNA]]-Defektstellen an [[Guanosin]]en zu reparieren. Hierbei wird eine Alkylgruppe von der ''O''6-Alkylguanin-DNA auf eines der Cysteine der AGT übertragen. Das so kovalent modifizierte Enzym ist inaktiv. Die Substratspezifität der AGT ist niedrig, sie reagiert auch mit der Nucleobase ''O''6-Benzylguanin (BG). Diese Eigenschaft, die auch das SNAP-Protein auszeichnet, macht man sich auch im Verlauf der [[Molekülmarkierung|Markierung]] des Fusionsproteins zunutze.

Zur Markierung muss, wie bei allen Protein-Tags, zuerst die DNA-Sequenz des Teilfragments der AGT [[leseraster]]konform in die DNA-Sequenz des zu markierenden Proteins [[Klonierung|eingefügt]] werden. Daneben muss ein beliebiger [[Fluoreszenzfarbstoff]] chemisch an das SNAP-Substrat BG-NH2 gekoppelt werden. Über eine Aminogruppe am BG-NH2 wird der [[N-Hydroxysuccinimid|NHS]]-[[Ester]] des zu verwendenden Farbstoffs mittels einer SN2-Reaktion [[Kovalente Bindung|kovalent]] an das Substrat gebunden. Anschließend muss nun das Substrat mit dem Farbstoff durch die Membran hindurch in eine Zelle in Zellkultur diffundieren. Trifft es dort auf das SNAP-Protein, so wird durch den enzymatischen AGT-Anteil des Fusionsproteins die im Substrat enthaltene [[Ether]]funktion gespalten, das Guanin wird dadurch freigesetzt und eine direkt kovalente Bindung zwischen dem zu untersuchenden Protein und dem [[Farbstoff]] wird ausgebildet.

SNAP-Tag ist, wie das hieraus entwickelte [[CLIP-Tag]],<ref name="PMID18291317">A. Gautier, A. Juillerat, C. Heinis, I. R. Corrêa, M. Kindermann, F. Beaufils, [[Kai Johnsson|K. Johnsson]]: ''An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells.'' In: ''Chem. Biol.'' Band 15, Nummer 2, Februar 2008, S. 128–136, [[doi:10.1016/j.chembiol.2008.01.007]], PMID 18291317.</ref> ein [[eingetragenes Warenzeichen]] des Biotechnologieunternehmens ''[[New England BioLabs]]'' (NEB). Das CLIP-Protein ist ebenfalls eine Variante der AGT, jedoch spezifisch für Benzylcytosin(BC)-Derivate. Damit lassen sich zwei Proteine parallel und unabhängig voneinander in einer Zelle markieren.<ref name="PMID28360214">K. Thorn: ''Genetically encoded fluorescent tags.'' In: ''Mol. Biol. Cell.'' Band 28, Nummer 7, April 2017, S. 848–857, [[doi:10.1091/mbc.E16-07-0504]], PMID 28360214, {{PMC|5385933}}.</ref>

=== Reaktionsschema ===
[[Datei:SNAP-tag.svg|hochkant=0.5|zentriert]]

== Quellen und weiterführende Literatur ==
* Keppler, A. ''et al.'' (2004): ''Labeling of fusion proteins of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase with small molecules in vivo and in vitro.'' In: ''Methods.'' Bd. 32, S. 437–444. PMID 15003606
* Keppler, A. ''et al.'' (2004): ''Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells.'' In: ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' Bd. 101, S. 9955–9959. PMID 15226507
* Juillerat, A. ''et al.'' (2005): ''Engineering substrate specificity of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for specific protein labeling in living cells.'' In: ''[[ChemBioChem]]'' Bd. 6, S. 1263–1269. PMID 15934048
* Brecht, A. & Gibbs, T. (2005): {{Webarchiv |url=http://www.covalys.com/fileadmin/documents/brecht_bioforum_2005.pdf |text=''Self Labeling Protein Tags.'' |wayback=20070927235636}} In: ''Bioforum.'' Jg. 2005, Nr. 6, S. 50–51.

== Weblinks ==
* {{Webarchiv |url=http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/images/technologies_fig3.gif |text=Darstellung SNAP-Tag und CLIP-Tag |wayback=20110725085039}} (NEB)

== Einzelnachweise ==
<references />

[[Kategorie:Protein-Methode]]
[[Kategorie:Zellbiologie]]
[[Kategorie:Biochemisches Nachweisverfahren]]

Snap-Tag - Versionsgeschichte

imported>Drahreg01: Wikilink, Artikel folgt.