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2026-04-17T12:17:59Z

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Unter dem [[Akronym]] '''SELEX''' ([[Englische Sprache|engl.]]: '''''S'''ystematic '''E'''volution of '''L'''igands by '''EX'''ponential Enrichment'', zu deutsch: '''''S'''ystematische '''E'''volution von '''L'''iganden durch '''ex'''ponentielle Anreicherung'') versteht man in der [[Molekularbiologie]] ein [[Kombinatorische Chemie|kombinatorisches]] Verfahren zur [[Gerichtete Evolution|gerichteten Evolution]] von [[Oligonukleotid]]-Strängen, beispielsweise [[Einsträngige DNA|einsträngiger DNA]] oder [[RNA]]. Diese können als [[Ligand]]en spezifisch an ausgewählte [[Target (Biologie)|Targets]] binden.<ref name="ellington">A. D. Ellington u. a.: ''In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.'' in ''[[Nature]]'', 346/1990, S. 818–822</ref><ref name="gold">C. Tuerk u. a.: ''Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.'' In: ''[[Science]]'' 249/1990, S. 505–510.</ref>

== Eigenschaften ==
Die mit Hilfe der SELEX gewonnenen Oligonukleotid-Sequenzen werden ''[[Aptamer]]e'' genannt. Das Verfahren wird gelegentlich auch als '''In-vitro-Selektion''' oder '''In-vitro-Evolution''' bezeichnet. 
Einzelstrang-DNA-basierte (ssDNA) Aptamere sind nach Ellington und [[Jack Szostak|Szostak]]<ref name="ellington2">A. D. Ellington, J. W. Szostak: ''Selection in vitro of single-stranded DNA molecules that fold into specific ligand-binding structures.'' In: ''Nature'' 355/1992, S. 850–852</ref> wegen ihrer höheren Stabilität bei gleicher Spezifität besser geeignet als RNA-basierte Aptamere.<ref name="nrw">Landesumweltamt NRW: 2006: {{Toter Link |datum=2019-05 |url=http://www.lanuv.nrw.de/veroeffentlichungen/materialien/mat72/mat72.pdf |text=''Antibiotika, Resistenzen und Bakterien in Kläranlagen.'' |fix-attempted=ja |archivebot=}} (PDF; 4,2 MB) 2006</ref> 
SELEX® ist ein eingetragenes Warenzeichen der Firma [[Gilead Sciences]].

== Das Verfahren ==
[[Datei:Selex.png|mini|Das SELEX-Verfahren]]
Zu Beginn des Verfahrens besteht die Synthese aus einer sehr großen Anzahl von unterschiedlichen Oligonukleotiden, die so genannte [[Molekülbibliothek]], auch ''Molekülpool'' genannt. Aus diesem Pool von bis zu 1016 und mehr unterschiedlichen Molekülen werden die Moleküle mit den gewünschten Eigenschaften durch gezielte Vermehrung herausisoliert ([[Separation|separiert]]). Die verschiedenen Moleküle konkurrieren miteinander und die Moleküle, welche die gestellte Anforderung beziehungsweise Aufgabe am besten erfüllen, werden [[Selektion (Evolution)|selektiert]] und weiter vermehrt. Anschließend werden die ausgewählten und vermehrten Moleküle erneut einer Selektion, unter variierten und meist verschärften Bedingungen, unterzogen. Danach werden wiederum nur die besten Moleküle erneut gezielt vermehrt. 
Durch den wiederholten Kreislauf von
* Selektion bindender RNA-Moleküle, (''Selektion'')
* Abtrennung nicht bindender Sequenzen, (''Separation'')
* enzymatischer Vervielfältigung der mit dem Zielmolekül interagierenden RNA-Liganden (''[[Amplifikation (Genetik)|Amplifikation]]'') und
* (optionaler) ''[[Mutation]]'',
erhält man üblicherweise Sequenzen, die sehr spezifisch und [[Affinität (Biochemie)|hochaffin]] an den gewünschten [[Target (Biologie)|Targets]] binden.<ref name="disskainz">Sabine Kainz: ''[http://d-nb.info/979079160/34 Selektion und Charakterisierung von Aptameren, spezifisch für das Virus der Infektiösen Bursitis.]'' Dissertation, Hamburg 2005</ref> Diese evolutionäre Vorgehensweise ist besonders leicht mit Molekülen wie DNA oder RNA durchzuführen, da sie mit Hilfe der [[Polymerase-Kettenreaktion]] relativ einfach vermehrbar sind. Der Kreislauf ''Selektion – Separation – Amplifikation (– Mutation)'' wird bis zu zwölfmal wiederholt.

=== Die DNA/RNA-Bibliothek ===
[[Datei:Nukleinsäure.svg|mini|3'- und 5'-Ende einer Nukleinsäuresequenz]]
Die einzelsträngige DNA-Ausgangsbibliothek (ssDNA) wird meist durch chemische DNA-Synthesen mittels automatisierter [[Festphasensynthese]] hergestellt. Dabei wird ein DNA-Synthesizer so eingestellt, dass nicht ein Nukleotid an einer bestimmten Stelle gekuppelt wird, sondern eine Mischung aus allen vier [[Nukleobase]]n. Die [[Randomisierung|randomisierte]] Sequenz wird in der Mitte zwischen bekannten Sequenzen hergestellt, die für die Primererkennung notwendig sind.<ref name="unimr">{{Webarchiv |url=http://online-media.uni-marburg.de/chemie/bioorganic/vorlesung1/kapitel3.html?%2Fchemie%2Fbioorganic%2Fvorlesung1%2Fk3-02.html |text=Universität Marburg: Anwendung der PCR in der in vitro random selection |wayback=20160903163637 |archiv-bot=}}</ref>

Der durch PCR erzeugte doppelsträngige DNA- und in RNA umgeschriebene Pool kann nun im nächsten Schritt des Selektionsprozesses mit dem gewünschten Zielmolekül, unter sorgfältig ausgewählten Bedingungen, [[Inkubation|inkubiert]] werden.

Die Ausgangsbibliothek enthält für gewöhnlich einen Bereich von 20 bis 220 randomisierten Nukleotiden.<ref>D. P. Bartel, J. W. Szostak: ''Isolation of new ribozymes from a large pool of random sequences.'' In: ''Science'' 261/1993, S. 1411–1418</ref> An den Enden befinden sich konstante [[Primer|primerbindende]] 3'- bzw. 5'-Sequenzen. Im konstanten Bereich liegt meist eine [[Promotor (Genetik)|Promotorsequenz]], die für die [[In-vitro-Transkription|''In-vitro''-Transkription]] der RNA unerlässlich ist.<ref>A. A. Beaudry, G. F. Joyce: ''Directed evolution of an RNA enzyme.'' In: ''Science'' 257/1992, S. 635–641</ref>

Zwischen den beiden konstanten Enden befindet sich die eigentliche Zufallssequenz aus ''n''-Nukleotiden, was 4n verschiedene mögliche Sequenzen ergibt. Rein rechnerisch sind aus einer Zufallssequenz mit ''n'' Nukleotid-Elementen:

* n = 25 eine Bibliothek aus ca. 1015 Sequenzen,
* n = 50 eine Bibliothek aus ca. 1030 Sequenzen,
* n = 75 eine Bibliothek aus ca. 1045 Sequenzen,
* n = 100 eine Bibliothek aus ca. 1060 Sequenzen möglich.<ref name="nrw" />

Ein Mol, das heißt 6,022·1023 Moleküle eines ''23mers'' – eine [[Nukleotidsequenz]] mit 23 randomisierten Nukleobasen – wiegt ca. 7,5 kg. Um statistisch ein Molekül von jeder möglichen Variante zu haben, benötigt man 75 µg Oligonukleotid. Für eine 50-fache statistische Deckung benötigt man lediglich 3,75 mg Oligonukleotid. 
Völlig anders dagegen ist die Situation bei den längerkettigen Sequenzen. Für eine einfache statistische Deckung würde man, nach Abzug der Primer, beim ''40mer'' 13 kg, beim ''50mer'' 16 kg und beim ''100mer'' 32 kg benötigen.<ref name="nrw" /> Dies ist ab der ''40mer'' praktisch nicht mehr möglich.

Der Nachteil langer Zufallssequenzen ist, dass je länger die Zufallssequenz wird, desto kleiner wird der Ausschnitt der möglichen Sequenzen, den eine Probe im mg-Maßstab repräsentiert. Der Vorteil langer Zufallssequenzen ist dagegen, dass ein einziges ''100mer'' bereits 75 verschiedene ''25mer'' Sequenzen bzw. 50 verschiedene ''50mer'' Sequenzen enthält. Die kann das Selektionsverfahren deutlich beschleunigen.<ref name="nrw" />

=== Selektion ===
Die Inkubation zwischen den Nukleotid-Sequenzen und den Zielstrukturen (Targets) kann im [[Immobilisierung (Biotechnologie)|immobilisierten]] Zustand oder in Lösung stattfinden. Die Wechselwirkungskräfte zwischen der Vielzahl an Nukleotid-Sequenzen und den Zielstrukturen sind dabei sehr unterschiedlich. Die auf dem [[Schlüssel-Schloss-Prinzip]] basierende Bindung der Nukleotide ist von ihrer [[Sekundärstruktur]] extrem stark abhängig. Die Sekundärstruktur hängt wiederum sehr stark von der Sequenz, das heißt der Reihenfolge der [[Nukleobasen]] [[Adenin]], [[Guanin]], [[Cytosin]], [[Thymin]] (im Falle von DNA) bzw. [[Uracil]] (im Fall von RNA) ab.

Als Sekundärstrukturen werden beispielsweise ''Helices'', ''Triple-Helices'', ''[[Haarnadelstruktur|Haarnadel-Schleifen]]'', ''Pseudoknoten'' und ''G-Quartette'' beschrieben.<ref>N. Leontis u. a.: ''The non-Watson-Crick base pairs and their associated isostericity matrices.'' In: ''[[Nucleic Acids Research]]'', 30/2002, S. 3497–3531.</ref><ref>B. E. Eaton u. a.: ''Ribonucleosides and RNA.'' In: ''[[Annual Review of Biochemistry]].'' 64/1995, S. 837–863.</ref><ref>F. Jiang u. a.: ''Structural basis of RNA folding and recognition in an AMP-RNA aptamer complex.'' In: ''Nature'' 382/1996, S. 183–186.</ref><ref>Woese CR, ''Architecture of ribosomal RNA: constraints on the sequence of "tetra-loops.'' In: ''[[Proceedings of the National Academy of Sciences]].'' 87/1990, S. 8467–8471.</ref>

=== Separation ===
Durch unterschiedliche Waschschritte werden die an den Targets nur schwach oder gar nicht gebundenen Sequenzen von den gebundenen Sequenzen abgetrennt (separiert). Üblicherweise erfolgt die Abtrennung mit Hilfe der [[Affinitätschromatografie]]. Die gebundenen Sequenzen werden [[Elution|eluiert]] und mit der PCR vermehrt.<ref name="jarosch">F. Jarosch u. a.: ''In vitro selection using a dual RNA library that allows primerless selection.'' In: ''Nucleic Acids Research.'' 34/2006, S. 86.</ref>

=== Amplifikation ===
{{Hauptartikel|Polymerase-Kettenreaktion}}

Die [[Amplifikation (Genetik)|Amplifikation]] erfolgt durch eine [[Reverse Transkriptase|reverse Transkription]] (nur bei RNA) und die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Daraus entsteht ein Pool von DNA bzw. RNA-Molekülen mit – im Vergleich zum ursprünglichen Molekülpool – verbesserten Bindungseigenschaften zum Liganden. Mit diesem Schritt schließt sich der Kreislauf und wird nun für gewöhnlich acht bis zwölfmal wiederholt, bis ein gewünschtes Aptamer erhalten wird, oder nur wenig verschiedene Sequenzen angereichert sind. Durch [[Klonierung]] und [[DNA-Sequenzierung|Sequenzierung]] resultieren nach Abschluss der systematischen Evolution monoklonale Aptamere. Als mögliche Zielmoleküle (Targets) kommen verschiedenste Moleküle wie einfache organische Verbindungen, Proteine oder ganze Zellen in Frage.<ref name="disskainz" />

=== Mutation ===
Wie bereits bei der Molekülbibliothek beschrieben, ist eine komplette Randomisierung eines ''100meren'' Oligonukleotid mit 1060 (=4100) Varianten nicht realisierbar. Man kann nur ca. 1016 Moleküle produzieren. Die aus diesem limitierten Pool isolierten aktivsten Oligonukleotide, können zu einer weiteren Verbesserung durch mutagene PCR leicht verändert werden. Man spricht in diesem Fall auch von ''Nachrandomisieren''. Dabei werden die PCR-Bedingungen so eingestellt, dass die Polymerase während des Kopiervorganges Fehler macht. Eine Fehlerrate von beispielsweise 1 pro 20 Basenpaaren kann durch die Wahl der Bedingungen eingestellt werden.<ref name="unimr" />

Das Nachrandomisieren empfiehlt sich erst nach mehreren Durchläufen des ''Selektions-Separations-Amplifikations-Zyklus''. Es ist genau genommen kein gesonderter Prozessschritt, sondern eine Modifizierung des Amplifikations-Schrittes.

== Geschichte ==
Die SELEX-Methode wurde 1990 zeitgleich von Larry Gold<ref name="gold" /> und Andrew E. Ellington<ref name="ellington" /> entwickelt. Beide Ansätze basieren auf dem Prinzip der selektiven Erkennung von Zielstrukturen, vermittelt durch die 3-dimensionale Form von einzelsträngigen Nukleinsäuren. Gold verwendete dabei einsträngige DNA (''single strand DNA'', ssDNA), Ellington dagegen RNA mit definierter Oberflächenstruktur.<ref name="dissblank">{{Literatur |Autor=Michael Blank |Titel=Systematische Evolution von DNA-Aptameren zur Charakterisierung und Diagnostik von pathologisch veränderten Endothelzellen in Tumoren und entzündlichen Regionen des Rattenhirns |Ort=Tübingen |Datum=2002 |DNB=965284956 |URN=nbn:de:bsz:21-opus-5841 |Kommentar=Dissertation, Universität Tübingen}}</ref>

== Bedeutung des Verfahrens ==
Die Selektion neuer Enzyme auf RNA- und DNA-Basis, den sogenannten [[Ribozym]]en, ist in den Fokus der Forschung gerückt. Die katalytisch aktive RNA, die sich in spezifische dreidimensionale Formen faltet, kann wie ein auf [[Protein]]en basierendes Enzym Reaktionen [[Katalysator|katalysieren]]. Zudem können die Ribozyme wie ein [[Antikörper]] hochspezifisch kleine Moleküle oder Proteine molekular binden. 
Die Herstellung dieser Aptamere genannten, hochspezifischen Rezeptoren auf DNA- oder RNA-Basis, die an medizinisch relevante [[Target (Biologie)|Targets]] binden können, ist das Ziel von SELEX.<ref name="unimr" />

Das Verfahren wird genutzt, um Aptamere mit extrem hoher Bindungsaffinität an unterschiedliche Targets zu entwickeln. Auch kleine Moleküle wie [[Adenosintriphosphat|ATP]],<ref name="dieckmann">T. Dieckmann u. a.: ''Solution structure of an ATP-binding RNA aptamer reveals a novel fold.'' In: ''RNA'' 2/1996, S. 628–640.</ref> [[Adenosin]]<ref name="huizenga">D. E. Huizenga, J. W. Szostak: ''A DNA aptamer that binds adenosine and ATP.'' In: ''[[Biochemistry]].'' 34/1995, S. 656–665.</ref><ref name="burke">D. H. Burke, L. Gold: ''RNA aptamers to the adenosine moiety of S-adenosyl methionine: structural inferences from variations on a theme and the reproducibility of SELEX.'' In: ''Nucleic Acids Research.'' 25/1997, S. 2020–2024.</ref> und Proteine, wie beispielsweise [[Prion]]en<ref name="mercey">R. Mercey u. a.: ''Fast, reversible interaction of prion protein with RNA aptamers containing specific sequence patterns.'' In: ''Archives of Virology.'' 151/2006, S. 2197–2214.</ref> und [[Signalmolekül]]e wie [[Vascular Endothelial Growth Factor]] (VEGF),<ref name="ulrich">H. Ulrich u. a.: ''DNA and RNA aptamers: from tools for basic research towards therapeutic applications.'' In: ''[[Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening]].'' 9/2006, S. 619–632.</ref> sind Targets für Aptamere.

Im Bereich der [[Onkologie]] sind Aptamere sehr vielversprechende Liganden.<ref name="ferreira">C. S. Ferreira u. a.: ''DNA aptamers that bind to MUC1 tumour marker: design and characterization of MUC1-binding single-stranded DNA aptamers.'' In: ''[[Tumor Biology]].'' 27/2006, S. 289–301.</ref>

Das an VEGF bindende Aptamer [[Pegaptanib]] ist für die Behandlung der [[Makuladegeneration|altersabhängigen Makula-Degeneration]] (AMD)<ref name="ulrich" /><ref name="Vavvas">D. Vavvas, D. J. D’Amico: ''Pegaptanib (Macugen): treating neovascular age-related macular degeneration and current role in clinical practice.'' In: ''Ophthalmology Clinics of North America.'', 19/2006, S. 353–360.</ref> zugelassen.

Es ist allerdings zu beachten, dass extrem hohe Bindungsaffinitäten im sub-nanomolaren Bereich nicht unbedingt die Spezifität zum Zielmolekül erhöhen.<ref name="carothers">J. M. Carothers u. a.: ''Aptamers selected for higher-affinity binding are not more specific for the target ligand.'' In: ''Journal of the American Chemical Society.'' 128/2006, S. 7929–7937.</ref> Die sogenannte ''Off-Target-Bindung'' hat signifikante klinische Auswirkungen.

Die Entwicklungs- und Herstellungskosten für Biosensoren auf Aptamerbasis werden in der Literatur als erheblich niedriger eingeschätzt als auf Basis von Proteinen (z. B. Antikörper).<ref name="nrw" />

== Molekülmodifikationen ==
Die Verwendung von 2’-Fluor- oder 2’-Amino-Mononukleotid-Triphosphat modifizierten RNA-Bibliotheken ermöglicht die Gewinnung von [[Ribonuklease]]-resistenten Aptameren.<ref>B. Eaton u. a. in ''[[Annual Review of Biochemistry]].'' 64/1994, S. 837–863</ref> Derart modifizierte Aptamere haben das Potenzial, auch in biologischen Flüssigkeiten ([[Blut]], [[Urin]]) als Sonde zu fungieren.<ref name="dissblank" /><ref>W. Pieken in ''Science'', 253/1991, S. 314–317</ref>

== Literatur ==
* Michael G. Radermacher: [http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/4421/pdf/Dissertation.pdf ''Entwicklung eines DNS-Aptamers gegen das aktivierte Integrin GP IIB/IIIA.''] (PDF; 4,6 MB) Dissertation, 2007, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.
* Sylvia Ehses: ''[http://d-nb.info/975889311/34 Isothermale in vitro Selektion und Amplifikation zur Untersuchung von Evolutionsvorgängen.]'' Dissertation, 2005, Ruhr-Universität Bochum
* Claudia Catharina Gauglitz: ''[http://www.diss.fu-berlin.de/2000/1/ Direkte und nichtkompetitive Bestimmung von Bindungskonstanten mit fluoreszierenden RNA-Liganden.]'' Dissertation, 2000, FU Berlin
* Mark Matzas: ''[http://d-nb.info/97879690X/34 Selektion und Identifikation von Peptid Nukleinsäuren.]'' Dissertation, 2005, Universität Hamburg

== Weblinks ==
* [http://www.ufz.de/index.php?de=14146 Helmholtz-Zentrum für Umweltforschung: FluMag – SELEX]

== Einzelnachweise ==
<references />

[[Kategorie:Nukleinsäure-Methode]]
[[Kategorie:Molekularbiologie]]
[[Kategorie:Markenname]]
[[Kategorie:Abkürzung]]

SELEX - Versionsgeschichte

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