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Die '''Proteinsequenzierung''' bezeichnet biochemische Methoden zur Bestimmung der [[Aminosäuresequenz]] von [[Protein]]en oder [[Peptid]]en. Sie ist als [[Proteincharakterisierung]] von wesentlicher Bedeutung in der [[Proteomik]].

== ''De-Novo''-Sequenzierung ==
{{Hauptartikel|De-Novo-Peptidsequenzierung}}
Wenn keine Datenbank-Daten benutzt werden bzw. vorhanden sind, wird die Sequenzierung ''De-Novo'' genannt. Die Proteinsequenzierung per massenspektrometrischer Analyse erfolgt durch zusätzliche Fragmentierung der Peptide und einer Auftrennung in einem [[Reflektron]].

== Edman-Abbau ==
{{Hauptartikel|Edman-Abbau}}
Der [[Edman-Abbau]] ist die klassische Methode zum Sequenzieren von Peptiden und Proteinen, er wird heutzutage aber nur noch selten verwendet. Im Edman-Abbau wird in einem zyklischen Prozess in jedem Reaktionszyklus die [[N-Terminus|N-terminale]]
Aminosäure [[Derivat (Chemie)|derivatisiert]], abgespalten und als [[Phenylisothiocyanat|Phenylthiohydantoin]]-Aminosäure
per [[HPLC]] identifiziert.<ref>{{cite journal |first=Pehr |last=Edman |coauthors=Geoffrey Begg |date=1967 |title=A protein sequenator |journal=European Journal of Biochemistry |pages=80–91 |doi=10.1111/j.1432-1033.1967.tb00047.x |language=en}}</ref>

Statt des Edman-Abbaus wird das Protein aus massenspektrometrischen Fragmentspektren sequenziert. Der Vorteil von massenspektrometrischen Verfahren gegenüber dem Edman-Abbau liegen in erster Linie in einem geringeren Probenbedarf und einer deutlich verkürzten Analysezeit.<ref>{{cite journal |first=M. |last=Wilm |coauthors=Shevchenko, A., Houthaeve, T., Breit, S., Schweigerer, L., Fotsis, T., & Mann, M. |date=1996 |title=Femtomole sequencing of proteins from polyacrylamide gels by nano-electrospray mass spectrometry |journal=Nature |volume=379 |issue=6564 |pages=466–469 |doi=10.1038/379466a0 |language=en}}</ref> Außerdem kann die Probe auch in geringerer Reinheit vorliegen und es können auch N-terminal blockierte (z. B. durch [[Acetylierung]], Formylierung) Peptide untersucht werden.

== Schlack-Kumpf-Abbau ==
{{Hauptartikel|Schlack-Kumpf-Abbau}}
Beim Schlack-Kumpf-Abbau wird [[C-Terminus|''C''-terminal]] sequenziert.

== Nanoporen-Sequenzierung ==
Bei einem Durchtritt von einzelnen linearisierten Proteinen durch Nanoporen kann über die Veränderung der [[Elektrische Leitfähigkeit|elektrischen Leitfähigkeit]] an der Nanopore die Aminosäureabfolge bestimmt werden. Diese Methode ist eine Weiterentwicklung der [[DNA-Sequenzierung]] mit Nanoporen.<ref>Y. Yang, R. Liu, H. Xie, Y. Hui, R. Jiao, Y. Gong, Y. Zhang: ''Advances in nanopore sequencing technology.'' In: ''Journal of nanoscience and nanotechnology.'' Band 13, Nummer 7, Juli 2013, {{ISSN|1533-4880}}, S. 4521–4538, PMID 23901471.</ref>

== Protein-Identifikation ==
=== Indirekte Sequenzierung ===
Um die Aminosäuresequenz eines Proteins zu bestimmen, wird meist entweder die Gensequenz der DNA aus einer [[DNA-Sequenzierung]] oder aus einer Datenbank sequenzierter [[Genom]]e wie [[BLAST-Algorithmus|tBLAST]] ''[[in silico]]'' in eine Proteinsequenz übersetzt. Durch [[Molekulares Display|molekulare Displays]] kann die Gensequenz eines Proteins erhalten werden. Daneben eignen sich auch noch massenspektrometrische Verfahren und der (eher historisch verwendete) Edman-Abbau zur direkten Identifizierung eines Proteins.

=== Massenspektrometrische Proteinanalytik ===
Die wichtigste Methode zur direkten Sequenzierung von Proteinen ist die [[Massenspektrometrie#Biochemie|Massenspektrometrie]] mit Hilfe des [[Peptidmassenfingerprint]].<ref>{{cite journal |first=Joshua J. |last=Coon |title=Collisions or Electrons? Protein Sequence Analysis in the 21st Century |journal=Anal. Chem. |volume=81 |issue=9 |pages=3208–3215 |doi=10.1021/ac802330b |date=2009-04-13 |language=en}}</ref> Ihre Bedeutung wuchs in den letzten Jahren stark, auch in Zusammenhang mit der sich verbessernden Computertechnik. Prinzipiell können mit Massenspektrometrie Proteine jeder Größe sequenziert werden, die Berechnung der Sequenz gestaltet sich jedoch mit zunehmender Größe immer schwieriger. Zudem sind Peptide aufgrund ihrer besseren [[Löslichkeit]] leichter zu präparieren. Das Protein wird daher zunächst mit einer [[Endoprotease]] verdaut und die resultierende Lösung durch [[HPLC]] separiert.

Im Massenspektrometer müssen die Peptide zunächst [[ion]]isiert werden. Eine der beiden häufig verwendeten Methoden zur Ionisation ist die [[Elektrospray-Ionisation]], die andere die Matrix-unterstützte Laserdesorption/Ionisation ([[MALDI]]). Bei erster wird die Lösung durch eine dünne Düse mit hohem, positivem Potential (positiver Ladung) ins Massenspektromer gesprüht. Die Tröpfchen zerfallen im Vakuum, bis nur noch einzelne Ionen vorliegen. Die Peptide [[Fragmentierung (Massenspektrometrie)|fragmentieren]] dann, das [[Masse-zu-Ladung-Verhältnis]] der Fragmente wird gemessen. Das resultierende Fragment-Spektrum wird mit Programmen analysiert und mit Datenbanken abgeglichen. Der Prozess wird meist anschließend mit einem anders verdauten Protein wiederholt, um aus den Fragmenten das ursprüngliche Protein rekonstruieren zu können.

Für die Analyse der Fragment-Spektren ist hilfreich, dass Fragmentierungen in erster Linie an den Peptidbindungen auftreten (b- und y-Fragmente in der folgenden Abbildung):

[[Datei:Scheme fragment ions peptids de.svg|700px]]

Die Abbildung stellt verschiedene Möglichkeiten für die Bildung von Fragmenten aus einem (protonierten) Peptid bestehend aus n Aminosäuren dar. Die Nomenklatur der verschiedenen Fragmente – z. B. b1-Fragment oder y4-Fragment (= yn-1-Fragment bei n=4 Aminosäuren) – geht auf Vorschläge von Roepstorff, Fohlman und Biemann zurück.<ref>{{cite journal |first=P. |last=Roepstorff |coauthors=Fohlman |date=1984 |title=Proposal for a common nomenclature for sequence ions in mass spectra of peptides. Biomed Mass Spectrom |journal=Biomedical Mass Spectrometry |volume=11 |issue=11 |pages=601 |doi=10.1002/bms.1200111109 |language=en}}</ref><ref>Biemann, K. (1992) Mass spectrometry of peptides and proteins. Annu Rev Biochem 61: 977-1010.</ref> Die Fragmente der N-terminalen Serie werden mit a, b und c bezeichnet, die der C-terminalen Serie mit x, y und z. Im Index wird zudem die Zahl der enthaltenen Aminosäuren angegeben. Die seltener auftretenden Fragmente der Aminosäure-Seitenketten werden mit d, v und w gekennzeichnet. Letztere Fragmente können die Unterscheidung von [[Leucin]] und [[Isoleucin]] in der Kette ermöglichen.<ref>{{Literatur |Autor=Christian Schmelzer |Titel=Massenspektrometrische Charakterisierung von Proteinhydrolysaten: Verdaustudien an ''beta''-Casein und Strukturuntersuchungen an Elastin |Datum=2007 |Online=[https://sundoc.bibliothek.uni-halle.de/diss-online/07/07H112/prom.pdf Online] |Format=PDF |Sprache=de}}</ref>

== Einzelnachweise ==
<references />

== Literatur ==
* [[Friedrich Lottspeich]], [[Joachim W. Engels]], Solodkoff, Zettlmeier, Lay: ''Bioanalytik''. 3. Auflage, Spektrum, Heidelberg, 2012, ISBN 978-3-8274-0041-3.
* [[Hubert Rehm]], Thomas Letzel: ''Der Experimentator: Proteinbiochemie / Proteomics''. 6. Auflage, Spektrum, Heidelberg 2009, ISBN 978-3-8274-2312-2.

[[Kategorie:Protein-Methode]]
[[Kategorie:Biochemisches Nachweisverfahren]]

Proteinsequenzierung - Versionsgeschichte

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