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Das '''Proteindesign''', synonym ''Proteinoptimierung'' oder ''rationales Proteindesign'', bezeichnet die gezielte Anpassung der Eigenschaften von [[Proteine]]n durch [[Peptidsynthese]], [[Gensynthese]] oder [[ortsspezifische Mutagenese]] der proteincodierenden [[Desoxyribonukleinsäure|DNA]]. Sie ist neben der zufällig entstehenden [[Gerichtete Evolution|gerichteten Evolution]] eine der beiden Strategien des [[Protein-Engineering]].

== Prinzip ==
Ziele des Proteindesigns sind Veränderungen von
* [[Überexpression|Expressionsmengen]]
* Bindungseigenschaften (z. B. [[Dissoziationskonstante|Substrataffinität]], [[Enzymspezifität|Substratspezifität]], Affinität zu anderen Bindungspartnern)
* [[Enzymkinetik|katalytischen]] Eigenschaften (z. B. [[Wechselzahl|Stoffumsatz]], [[Michaelis-Menten-Theorie|Substratsättigung]])
* [[Toxin|toxischen]] Eigenschaften
* [[Immunreaktion|immunologischen]] Eigenschaften (z. B. Repetitive [[Epitop]]e, [[Haupthistokompatibilitätskomplex|MHC-Bindung]], [[Konsensussequenz]]en verschiedener Stämme, Maskierung durch [[Glycosylierung]]en)
* die Lokalisation in einem [[Zellkompartiment]]
* im Falle von ''[[Inclusion Bodies]]'' die [[Löslichkeit]]
* Erhöhung der [[Biologische Halbwertszeit|biologischen Halbwertszeit]] durch Minderung der [[Proteolyse]] und Erhöhung der [[Denaturierung (Biochemie)|Denaturierungs-]] und [[Thermostabilität]]

== Verfahren und Effekte ==
Die gezielte Veränderung [[Rekombinantes Protein|rekombinanter Proteine]] kann zu Funktionsverlusten oder -gewinnen führen. Neben den gezielten Veränderungen an Protein werden zur Steigerung der [[Genexpression]] im Zuge eines [[Vektordesign]]s meistens auch DNA-Abschnitte außerhalb der proteincodierenden Sequenz verändert. Durch die Wahl eines für die jeweilige [[Art (Biologie)|Art]] geeigneten [[Promotor (Genetik)|Promotors]], [[Enhancer (Genetik)|Enhancers]] und [[Terminator (Genetik)|Terminators]] kann die Genexpression gesteigert werden. Weiterhin kann durch eine [[Shine-Dalgarno-Sequenz]] (bei Bakterien) oder eine [[Kozak-Sequenz]] (bei Eukaryoten) die Erkennung der [[mRNA]] am [[Ribosom]] verbessert und durch ein [[Polyadenylierung]]ssignal am 3’-Ende und durch die Vermeidung von AUUUA-Sequenzen kann der vorzeitige Abbau der mRNA gemindert werden.

=== Punktmutationen ===
Durch eine ''[[Codon]]-Optimierung'' kann die Expressionsrate gesteigert werden, indem nur diejenigen 20 Aminosäurecodons verwendet werden, die in der jeweiligen Art am stärksten exprimiert werden (siehe [[Codon Usage]]).<ref>E. Kotsopoulou, V. N. Kim, A. J. Kingsman, S. M. Kingsman, K. A. Mitrophanous: ''A Rev-independent human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-based vector that exploits a codon-optimized HIV-1 gag-pol gene''. In: ''J Virol.'', 2000, Band 74(10), S. 4839–4852. PMID 10775623; {{PMC|112007}}.</ref> Eine gehäufte Verwendung suboptimaler Codons ist dagegen eine Methode zur [[Attenuierung]] von viralen [[Lebendimpfstoff]]en.<ref>S. Mueller, J. R. Coleman, E. Wimmer: ''Putting synthesis into biology: a viral view of genetic engineering through de novo gene and genome synthesis.'' In: ''Chemistry & biology.'' Band 16, Nummer 3, März 2009, S. 337–347, [[doi:10.1016/j.chembiol.2009.03.002]], PMID 19318214, {{PMC|2728443}}.</ref> Neben den Codons können auch andere RNA-Sequenzen sich auf die Menge an gebildetem Protein auswirken und werden bei einer Codon-Optimierung mit einbezogen.<ref>S. Fath, A. P. Bauer, M. Liss, A. Spriestersbach, B. Maertens, P. Hahn, C. Ludwig, F. Schäfer, M. Graf, R. Wagner: ''Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance autologous mammalian gene expression.'' In: ''[[PLOS ONE]].'' Band 6, Nummer 3, März 2011, S. e17596, [[doi:10.1371/journal.pone.0017596]], PMID 21408612, {{PMC|3048298}}.</ref> [[Posttranslationale Modifikation|Posttranslational]] modifizierbare Aminosäuren, wie sie in Glycosylierungs-, [[Phosphorylierung]]s-, [[Methylierung]]s-, [[Acetylierung]]s-, [[Sulfatierung (Biologie)|Sulfatierungs-]], [[Myristylierung]]s-, [[Palmitoylierung]]s-, [[Prenylierung|Farnesylierungs-]], [[GPI-Anker]]- und [[Geranylgeranylierung]]sstellen vorkommen, können durch gezielte [[Punktmutation]]en in der DNA in das Protein eingeführt oder entfernt werden.

Durch die Veränderung eines [[Aktives Zentrum|katalytischen Zentrums]], einer [[Substrat (Biochemie)|Substratbindungsstelle]] oder einer für eine Aktivierung notwendigen [[Bindungsstelle]] für andere Moleküle (z. B. bei [[Kofaktor (Biochemie)|Kofaktoren]], temporären [[Protein-Protein-Interaktion]]en oder bei [[Proteinkomplex]]en) können [[Kompetitive Hemmung|kompetitive]] [[Inhibitor]]en erzeugt werden.

Die [[Biologische Halbwertszeit]] eines Proteins kann verlängert werden, in dem [[Peptidase]]schnittstellen, [[PEST-Sequenz]]en und bestimmte ''N''-terminale Aminosäuren aus der [[N-End Rule]] geändert werden.

Punktmutationen können auch über die Veränderung der Primärstruktur die Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur beeinflussen, wie unter anderem über [[Disulfidbrücke]]n-ausbildende [[Cystein]]e. [[α-Helix|α-Helices]] können durch ''rotationsflexible'' ([[Glycin]]), ''helixbildende'' (z. B. [[Alanin]]) und ''helixbrechende'' Aminosäuren ([[Prolin]]) modifiziert werden. Unübliche [[Aminosäure]]n können über die Verwendung eines [[Erweiterter genetischer Code|erweiterten genetischen Codes]] eingeführt werden.<ref>R. Martin: ''Methods in Molecular Biology, Vol. 77: Protein Synthesis'', Humana, New Jersey 1998. ISBN 978-0-89603-397-9.</ref>

=== Insertionen und Deletionen ===
Neue [[Proteindomäne]]n und damit einhergehende Funktionen können durch [[leseraster]]konforme [[Insertion (Genetik)|Insertionen]] von DNA-Sequenzen (aus Multiplen von drei Nukleotiden) in ein Gen hinzugefügt werden, die entstehenden hybriden Proteine bezeichnet man als [[Fusionsprotein]]e.

Gelegentlich werden zur [[Proteinreinigung|Aufreinigung]] und zum [[Proteincharakterisierung|Nachweis]] kurze leserasterkonforme DNA-Sequenzen hinter das [[Startcodon]] oder vor das [[Stopcodon]] des Gens eingefügt, welche als [[Protein-Tag]]s bezeichnet werden.

Weitere übliche Insertionen sind flexible Verbindungen (engl. ''{{lang|en|linker}}'', zwischen zwei [[Proteindomäne]]n eines [[Fusionsprotein]]s), daneben auch [[Intein]]e, [[2A-Peptide]] oder [[Protease]]-Erkennungssequenzen, die eine Abspaltung eines Teils des Proteins ''[[in vitro]]'' oder ''[[in vivo]]'' ermöglichen.

Transiente Insertionen können durch das Einfügen von [[Intein]]en oder durch Verwendung des [[Cre-lox-System]]s erzeugt werden.

Durch leserasterkonforme [[Deletion]]en von Multiplen von drei Nukleotiden können Eigenschaften entfernt werden. Dabei können gelegentlich auch andere Eigenschaften des Proteins in den Vordergrund treten, wie z. B. bei der Entfernung regulatorischer Domänen. Die Lokalisation in einem [[Zellkompartiment]] kann durch Hinzufügen oder Entfernen von [[Signalsequenz]]en verändert werden. Durch das Hinzufügen oder Entfernen einer [[Transmembrandomäne]] können lösliche Proteine und [[Membranprotein]]e ineinander überführt werden. Bei einer Insertion von codierenden Sequenzen für [[Zellpenetrierendes Peptid|zellpenetrierende Peptide]] kann der Zelleintritt eines Proteins erhöht werden.

=== Multimerisierung ===
Durch Veränderung von viralen [[Kapsid]]proteinen oder durch [[multimer]]isierende Proteine können größere Proteinpartikel erzeugt werden.<ref name="DOI10.1038/nchem.2107">Yen-Ting Lai, Eamonn Reading, Greg L. Hura, Kuang-Lei Tsai, Arthur Laganowsky, Francisco J. Asturias, John A. Tainer, Carol V. Robinson, Todd O. Yeates: ''Structure of a designed protein cage that self-assembles into a highly porous cube.'' In: ''Nature Chemistry.'' 2014, [[doi:10.1038/nchem.2107]].</ref>

=== Stabilisierung ===
Verschiedene kleine Proteine (meist unter 200 Aminosäuren) werden als Gerüst zur Stabilisierung verwendet, z. B. [[Affibody|Affibodies]], [[Affimer]]e, ''ankyrin repeat proteins'' (''DARPins''), ''Repebodies'', [[Anticalin]]e, [[Fibronectin]]e und Kunitz-[[Proteindomäne]]n.<ref>A. Skerra: ''Alternative non-antibody scaffolds for molecular recognition.'' In: ''Current Opinion in Biotechnology.'' Band 18, Nummer 4, August 2007, S. 295–304, [[doi:10.1016/j.copbio.2007.04.010]]. PMID 17643280.</ref><ref>M. Gebauer, A. Skerra: ''Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics.'' In: ''Current opinion in chemical biology.'' Band 13, Nummer 3, Juni 2009, S. 245–255, [[doi:10.1016/j.cbpa.2009.04.627]]. PMID 19501012.</ref> [[Cyclopeptide]] sind geschlossen ringförmige Peptide, die durch die Zyklisierung keine Enden aufweisen und eine größere biologische Halbwertszeit aufweisen. Durch [[Vernetzung (Chemie)|Vernetzung]] können Proteine stabilisiert werden, z. B. bei einer [[Immobilisierung (Biotechnologie)|Immobilisierung]]. Per [[Peptidsynthese]] erzeugte [[β-Peptide]] besitzen ein verlängertes Peptid-Rückgrat.

=== Kopplung ===
{{Hauptartikel|Vernetzung (Chemie)}}
Durch Vernetzungsmittel können z. B. zwei Proteine ''in vitro'' aneinander gekoppelt werden.

=== Markierung ===
{{Hauptartikel|Molekülmarkierung}}
Im Zuge einer Markierung können verschiedene Signalmoleküle an ein Protein gehängt werden.

== Beispiele ==
Im beginnenden 21. Jahrhundert beschleunigte sich die Entwicklung des Proteindesigns durch den Einsatz der [[Molekulare Modellierung|molekularen Modellierung]] am [[Computer]]. Beispiele für diese Entwicklung umfassen [[Stereoselektivität|stereoselektive]] [[Katalyse]]n,<ref>Alan Saghatelian, Yohei Yokobayashi, Kathy Soltani, M. Reza Ghadiri: ''A chiroselective peptide replicator.'' In: ''Nature.'' 409, S. 797–801, [[doi:10.1038/35057238]].</ref> die Detektion von [[Ion]]en,<ref>T. Nagai: ''Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+.'' In: ''[[Proceedings of the National Academy of Sciences]].'' 98, S. 3197–3202, [[doi:10.1073/pnas.051636098]].</ref> und [[Viren|antivirale]] Eigenschaften.<ref>M. J. Root: ''Protein Design of an HIV-1 Entry Inhibitor.'' In: ''[[Science]]'', 291, S. 884–888, [[doi:10.1126/science.1057453]].</ref>

Durch computergestützte Methoden wurde im Jahr 2003 eine neue, künstliche [[Proteinfaltung]] erzeugt (Top7),<ref>B. Kuhlman: ''Design of a Novel Globular Protein Fold with Atomic-Level Accuracy.'' In: ''[[Science]]'', 302, 2003, S. 1364–1368, [[doi:10.1126/science.1089427]].</ref> ebenso entstanden so auch Sensoren für unnatürliche Moleküle.<ref>Loren L. Looger, Mary A. Dwyer, James J. Smith, Homme W. Hellinga: ''Computational design of receptor and sensor proteins with novel functions.'' In: ''Nature.'' 423, 2003, S. 185–190, [[doi:10.1038/nature01556]].</ref> Auch die Spezifität für [[Kofaktor (Biochemie)|Kofaktoren]] der Xylose-Reductase von ''Candida boidinii'' wurde von [[Nicotinamidadenindinukleotidphosphat|NADPH]] zu [[Nicotinamidadenindinukleotid|NADH]] geändert.<ref name="khoury">George A. Khoury, Hossein Fazelinia, Jonathan W. Chin, Robert J. Pantazes, Patrick C. Cirino, Costas D. Maranas: ''Computational design of xylose reductase for altered cofactor specificity.'' In: ''Protein Science'', 18, 2009, S. 2125–2138, [[doi:10.1002/pro.227]].</ref>

Dabei sind jedoch vermutlich nicht alle Proteinstrukturen per Proteindesign erhältlich, da manche [[Konfiguration (Chemie)|Konfigurationen]] und [[Konformation]]en sich aus sterischen Gründen nicht ausbilden können. Ebenso existieren Software-basierte Grenzen der Veränderungsmöglichkeiten.

== Software ==
* ''IPRO'' verändert die Proteine zur Erhöhung der [[Affinität (Biochemie)|Affinität]] zu einem Substrat oder Kofaktor.<ref name="khoury" /> Dies wird durch mehrere zufällige Veränderungen des Proteinrückgrates im Bereich spezifischer Positionen zur Identifikation der niedrigsten Energiekombinationen der Rotamere und zur Bestimmung der Konfiguration mit der niedrigsten Energie bei einer gezielten Veränderung. Der iterative Herangehensweise erlaubt IPRO die additive Berechnung mehrerer Mutationen zur Optimierung der Substratspezifität oder Kofaktorbindung.
* ''EGAD: A Genetic Algorithm for protein Design''.<ref>{{Cite web|url=http://egad.ucsd.edu/EGAD_manual/index.html |title=User’s Manual for EGAD! a Genetic Algorithm for protein Design!| accessdate=2013-10-17| archiveurl=https://web.archive.org/web/20090502192116/http://egad.ucsd.edu/EGAD_manual/index.html| archivedate=2009-05-02}}</ref> Ein kostenloses Softwarepaket zum Proteindesign und zur Voraussage der Effekte von Mutationen bezüglich der Proteinfaltung und der Affinität. EGAD bezieht auch parallel mehrere Strukturen beim Entwurf von Bindestellen oder fixierten Konformationen. Daneben können auch bewegliche Liganden mit oder ohne rotierenden Bindungen berechnet werden. EGAD kann auch mit mehreren Prozessoren verwendet werden.

* ''RosettaDesign''. Ein Softwarepaket, das kostenlos für den akademischen Gebrauch ist.<ref>Y. Liu, B. Kuhlman: ''RosettaDesign server for protein design.'' In: ''[[Nucleic Acids Research]]'', 34, 2006, S. W235–W238, [[doi:10.1093/nar/gkl163]].</ref><ref>Gautam Dantas, Brian Kuhlman, David Callender, Michelle Wong, David Baker: ''A Large Scale Test of Computational Protein Design: Folding and Stability of Nine Completely Redesigned Globular Proteins.'' In: ''[[Journal of Molecular Biology]].'' 332, 2003, S. 449–460, [[doi:10.1016/S0022-2836(03)00888-X]].</ref><ref>Gautam Dantas, Colin Corrent, Steve L. Reichow, James J. Havranek, Ziad M. Eletr, Nancy G. Isern, Brian Kuhlman, Gabriele Varani, Ethan A. Merritt, David Baker: ''High-resolution Structural and Thermodynamic Analysis of Extreme Stabilization of Human Procarboxypeptidase by Computational Protein Design.'' In: ''Journal of Molecular Biology'', 366, 2007, S. 1209–1221, [[doi:10.1016/j.jmb.2006.11.080]].</ref> RosettaDesign ist über einen Webserver erhältlich.<ref>[http://rosettadesign.med.unc.edu/ Rosetta Design.] Abgerufen am 20. August 2012.</ref>
* ''Sharpen'' ist eine Open-Source Bibliothek zum Proteindesign und zur Strukturvorhersage.<ref>[http://sharpen.engr.colostate.edu/ ''SHARPEN''.] Abgerufen am 20. August 2012.</ref> SHARPEN bietet unterschiedliche kombinatorische Optimierungsmethoden (z. B. Monte Carlo, [[Simulierte Abkühlung]], FASTER<ref>Johan Desmet, Jan Spriet, Ignace Lasters: ''Fast and accurate side-chain topology and energy refinement (FASTER) as a new method for protein structure optimization.'' In: ''Proteins: Structure, Function, and Genetics.'' 48, 2002, S. 31–43, [[doi:10.1002/prot.10131]].</ref>) und bewertet die Proteine anhand des ‘’Rosetta all-atom force field" oder des ‘’molecular mechanics force fields’’ (OPLSaa). Daneben beinhaltet SHARPEN auch die Möglichkeit zur Berechnung mit mehreren Prozessoren.
* ''WHAT IF software''. Eine Software zur Modellierung, zum Proteindesign, zur Validierung und zur Visualisierung von Proteinen.
* ''CheShift'' ist eine Software zur Validierung von Proteinstrukturen.
* ''Abalone'' ist eine Software zur Modellierung und Visualisierung.<ref>[https://www.biomolecular-modeling.com/Abalone/index.html ''Abalone''.] Abgerufen am 20. August 2012.</ref>
* ''ProtDes'' ist eine Software zum Proteindesign, basierend auf dem ‘’CHARMM molecular mechanics package‘‘.<ref>[http://soft.synth-bio.org/protdes.html ''PROTDES''.] Abgerufen am 20. August 2012.</ref>

== Literatur ==
* [[Friedrich Lottspeich]], Haralabos Zorbas: ''Bioanalytik''. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 1998, ISBN 978-3-8274-0041-3.
* [[Hubert Rehm]], Thomas Letzel: ''Der Experimentator: Proteinbiochemie / Proteomics''. 6. Auflage. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2009, ISBN 978-3-8274-2312-2.
* E. Buxbaum: ''Fundamentals of Protein Structure and Function''. Springer, New York 2007, ISBN 978-0-387-26352-6.
* P. Kaumaya: ''Protein Engineering''. Intech, 2012, ISBN 978-953-510-037-9 (englisch); [https://www.intechopen.com/books/protein-engineering intechopen.com]
* K. P. Murphy: ''Methods In Molecular Biology, Vol. 168: Protein Structure, Stability, And Folding''. Humana, New Jersey 2001, ISBN 978-0-89603-682-6.
* T. Vo-Dinh: ''Methods in Molecular Biology, Vol. 300: Protein Nanotechnology, Protocols, Instrumentation, and Applications''. Humana, New Jersey 2004, ISBN 978-1-58829-310-7.
* R. Guerois, M. de la Paz: ''Methods in Molecular Biology''. Vol. 340: ''Protein Design''. Humana, New Jersey 2006, ISBN 1-59745-116-9.
* K. Arndt, K. Muller: ''Methods in Molecular Biology''. Vol. 352: ''Protein Engineering Protocols'', Humana, New Jersey 2007. ISBN 978-1-58829-072-4.
* Kevin M. Ulmer: ''Protein engineering''. In: ''[[Science]]'', 1983, Band 219(4585), S. 666–671. PMID 6572017.

== Einzelnachweise ==
<references />

[[Kategorie:Protein-Methode]]

Proteindesign - Versionsgeschichte

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