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2022-10-05T14:56:33Z

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Die '''Primer Extension''' [ˊpʁaɪ̯mɐ][ɪkˊstenʃn] ist eine [[Molekularbiologie|molekularbiologische]] Methode, die im Allgemeinen zur Bestimmung der [[Basensequenz]] des [[5'-Ende]]s der [[mRNA]] dient. Dazu werden aus einem Gemisch von [[RNA]]-Molekülen die 5'-Enden einer bestimmten RNA-Spezies ermittelt. Das 5'-Ende ist zumeist auch ein [[Transkriptionsstartpunkt]] des betrachteten [[Gen]]s.

== Beschreibung der Methode ==
Bei der Primer Extension wird ein kurzes, (zumeist) synthetisch hergestelltes [[Desoxyribonukleinsäure|DNA]]-[[Oligonukleotid]] – der sogenannte [[Primer]] – an zuvor isolierte RNA angelagert. Dazu werden die RNA und der zuvor meistens mit [[T4-Polynukleotidkinase]] radioaktiv [[Molekülmarkierung|markierte]] Primer zusammengegeben und erhitzt. Durch das Erhitzen trennen sich doppelsträngige Bereiche der RNA. Nachfolgend wird der Ansatz wieder abgekühlt, wodurch sich der Primer an die komplementäre [[Basensequenz]] der RNA anlagern kann. Dadurch findet der Primer im RNA-Gemisch das entsprechende Gen.

Das System enthält im Wesentlichen noch zwei weitere Komponenten. Das sind die [[Desoxyribonukleosidtriphosphat]]e (dNTPs, kurz dATP, dCTP, dGTP und dTTP), die als [[Nukleinbasen]] fungieren und ein Enzym, das als [[Reverse Transkriptase]] bezeichnet wird. Die Reverse Transkriptase bindet am DNA/RNA-Hybrid-Molekül und füllt den Primer am [[3'-Ende]] mit Nukleotiden auf. Dabei dient die [[mRNA]] des betrachteten Gens als Matrize. Durch die Verlängerung (Extension) wird der Primer zur [[cDNA]]. Die cDNA kann nach Trennung von der RNA (z. B. durch alkalische Lyse und/oder [[RNase|RNA-abbauende Enzyme]]) einer weiterführenden Analyse unterzogen werden.

Im Allgemeinen läuft die weiterführende Analyse so, dass der cDNA aus dem Primer-Extension-Ansatz ein [[DNA-Sequenzierung|Sequenzierung]]s-Ansatz bereits bekannter genomischer DNA gegenübergestellt wird. Das bekannte, zumeist klonierte Stück DNA beinhaltet den Primer-Bereich und sollte an der "anderen" Seite über das noch nicht genau kartierte "vordere" Ende des betreffenden Gens hinausreichen. Die Sequenzier-Reaktionen werden mit dem gleichen Primer durchgeführt wie die cDNA-Synthese. Die Primer-Extension-Produkte und die Reaktionen der DNA-Sequenzierung werden auf ein sogenanntes „Sequenziergel“ aufgetragen und einer [[Elektrophorese]] unterzogen. Anhand des Vergleiches der DNA-Fragmentlängen kann der Transkriptionsstartpunkt ermittelt werden.

== Entstehung ==
Die Primer Extension wurde in den späten 1970ern entwickelt. Dabei wurden im Wesentlichen zwei Richtungen verfolgt und zusammengeführt: die DNA-Sequenzierung durch teilweisen Kettenabbruch<ref>Sanger, F. & Coulson, A. R. (1975): ''A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase.'' In: ''J. Mol. Biol.'' 94:441-444. PMID 1100841</ref><ref>Sanger, F. ''et al.'' (1977): ''DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.'' In: ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' 74:5463-5467. PMID 271968</ref> und die cDNA-Synthese durch Reverse Transkriptasen<ref>Thompson, J.A.''et al.'' (1979): ''Characterization of the 5'-terminal structure of simian virus 40 early mRNA's.'' In: ''J. Virol.'' 31:437-446. PMID 90173</ref><ref>Qu, H.L. ''et al.'' (1981): ''Improved methods for structure probing in large RNAs: a rapid 'heterologous' sequencing approach is coupled to the direct mapping of nuclease accessible sites. Application to the 5' terminal domain of eukaryotic 28S rRNA.'' In: ''Nucl. Acids. Res.'' 11:5903-5920. PMID 6193488</ref>. Während ''primer extension'' anfangs eher als Wortgruppe denn als Name einer Methode eingesetzt wurde, setzte sich der Begriff Anfang der 1980er als ''terminus technicus'' durch und bezeichnet zumeist die oben beschriebene Variante. Methoden, bei denen die Sequenzierung durch teilweisen Kettenabbruch direkt an die cDNA-Synthese gekoppelt sind, werden heute eher als ''direkte RNA-Sequenzierung'' bezeichnet.

== Homonyme und Synonyme ==
'''Homonyme''': Neben einigen von Primer Extension verschiedenen molekulargenetischen Methoden, bei denen ebenfalls die Verlängerung eines Oligonukleotides durch Nukleinsäurepolymerasen eine Rolle spielt, wird die Wortgruppe "...primer extension..." vor allem bei der Beschreibung der [[DNA-Replikation]] eingesetzt.

'''Synonyme''': cDNA extension by reverse transcriptase; reverse transcriptase mapping; RT-mapping; RT-Kartierung

== Einzelnachweise ==
<references />

== Literatur ==
*Walmsley, M. (2000): ''Primer Extension Analysis of mRNA.'' In: ''The Nucleic Acid Protocols Handbook.'' ISBN 978-0-89603-459-4
*Ross, W. & Gourse, R.L. (2008): ''Analysis of RNA polymerase-promoter complex formation.'' In: ''Methods.'' 47(1):13-24. PMID 18952176 {{DOI|10.1016/j.ymeth.2008.10.018}}

[[Kategorie:Genetik]]

Primer Extension - Versionsgeschichte

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