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2024-04-16T09:42:40Z

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Die '''Plasmidpräparation''' (auch ''Plasmidisolierung'') ist eine [[Molekularbiologie|molekularbiologische]] Methode zur Isolierung von [[Plasmid]]-[[Desoxyribonukleinsäure|DNA]] aus Bakterien.<ref>{{Internetquelle |url=https://www.hoelzel-biotech.com/de/anwendungs-infothek/plasmidpraeparation-info.html |titel=Plasmidpräparation - Info - Anwendungs Infothek - Ressourcen |abruf=2023-07-27}}</ref> Die Plasmidpräparation ist eine Variante der [[DNA-Extraktion]].

== Anwendung ==
Die Verwendung von [[Plasmid]]en erlaubt es, genetisches Material in [[Bakterien]] zu vervielfältigen oder bestimmte Gene in andere Organismen zu übertragen. Die [[Ausbeute (Chemie)|Ausbeute]] an Plasmiden hängt unter anderem vom Bakterienstamm, dem verwendeten [[Kulturmedium]], dem [[Replikationsursprung]] des Plasmids (sog. ''{{lang|en|high copy plasmids}}'' oder ''{{lang|en|low copy plasmids}}'') und den Kulturbedingungen ab ([[Schüttelmaschine (Labor)|Schüttler]] bis zu 200 Rotationen pro Minute, Form der Kulturflasche wie z. B. [[Schikanenkolben]], Temperatur). Zur Isolierung kleiner Mengen an Plasmiden (bis 25 µg) steht die Minipräp zur Verfügung, für größere Mengen bis 0,5 mg eignet sich die Maxipräp, darüber bis 2 mg die Megaprep und bis 10 mg die Gigaprep. Die Plasmidpräparation wird verwendet, um Plasmide aus [[Transformation (Genetik)|transformierten]] Bakterien, zumeist ''[[Escherichia coli]]'', präparativ zu isolieren.

== Alkalische Lyse ==
{{Hauptartikel|DNA-Extraktion}}
Es gibt mehrere Möglichkeiten zur Plasmidpräparation, eine häufig verwendete ist die '''alkalische Lyse'''.<ref>H. C. Birnboim, J. Doly: ''A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA.'' In: ''Nucleic Acids Res.'' (1979), Band 7(6), S. 1513–1523. PMID 388356; {{PMC|342324}}.</ref> Die Bakterien mit dem Plasmid werden mit ca. 5000 x g [[Zentrifuge|zentrifugiert]] und das [[Pellet]] anschließend in einem [[Pufferlösung|Puffer]] resuspendiert. Zur Degradation störender [[Ribonukleinsäure|RNA]] enthält die Lösung meist zusätzlich eine [[Rnase|RNase]]. Durch Zugabe einer Lösung von [[Natriumdodecylsulfat|SDS]] und [[Natriumhydroxid]] werden die Zellen durch das [[Detergens]] und die alkalische [[Verseifung]] der [[Lipide]] [[Lyse (Biologie)|lysiert]].

Durch die Zugabe von NaOH zum Zellextrakt wird der pH-Wert weit ins Alkalische verschoben. Dadurch lösen sich die Wasserstoff-Brückenbindungen zwischen den komplementären DNA-Strängen sowohl der chromosomalen als auch der Plasmid-DNA, wobei die Plasmid-DNA aufgrund ihrer Konformation in der Lage ist, vollständig zu renaturieren. Die chromosomale DNA, die durch die einzelnen Präparationsschritte zerstückelt wurde, kann nach Neutralisation des pH-Wertes mit Kaliumacetat und Eisessig nicht renaturieren, es bilden sich DNA-Doppelstränge mit nur kurzen komplementären Bereichen und durch die ungerichtete Verbindung vieler DNA-Einzelstränge kommt es zur Ausbildung einer verworrenen DNA-Masse. Diese kann relativ leicht abzentrifugiert werden. Bei diesem Zentrifugationsschritt setzen sich ferner Zellmembran- und Zellwandbestandteile sowie Proteine als Pellet ab. Die Plasmid-DNA befindet sich nach der Zentrifugation im Überstand.

Die gelöste [[Plasmid|Plasmid-DNA]] kann einer zusätzlichen Reinigung unterzogen werden z. B. einer [[Phenol-Chloroform-Extraktion]] oder einer [[Adsorption]] an [[DNA-Extraktion|Silicagel]].<ref>M. A. Marko, R. Chipperfield, H. C. Birnboim: ''A procedure for the large-scale isolation of highly purified plasmid DNA using alkaline extraction and binding to glass powder.'' In: ''Anal Biochem.'' (1982), Band 121(2), S. 382–387. PMID 6179438.</ref><ref>R. Boom, C. J. Sol, M. M. Salimans, C. L. Jansen, P. M. Wertheim-van Dillen, J. van der Noordaa: ''Rapid and simple method for purification of nucleic acids.'' In: ''J Clin Microbiol.'' (1990), Band 28(3), S. 495–503. PMID 1691208; {{PMC|269651}}.</ref><ref>T. A. Borodina, [[Hans Lehrach|H. Lehrach]], A. V. Soldatov: ''DNA purification on homemade silica spin-columns.'' In: ''Anal Biochem.'' (2003), Band 321(1), S. 135–137. PMID 12963065.</ref> Die DNA kann dann mit einem Alkohol wie [[Ethanol]] oder [[Isopropanol]] ausgefällt werden. Der Alkohol entzieht der DNA die [[Hydrathülle]]. Mit 70 % Ethanol wird die gefällte DNA dann gewaschen und steht dann zur weiteren Verarbeitung zur Verfügung. Zur Vermessung der Konzentration im [[Photometer]] kann die DNA zum Beispiel in [[Wasser]] oder [[TE-Puffer]] (pH 7,5) wieder gelöst werden.

== Koch-Lyse ==
Eine andere Aufschlussmethode stellt z. B. die sogenannte „'''Koch-Lyse'''“ dar. Dabei werden die bakteriellen Zellwände im Zuge eines [[Zellaufschluss]]es durch Zugabe von [[Lysozym]] zerstört und die lysierten Bakterien für kurze Zeit aufgekocht, bzw. in einem Heizblock bei 95 °C erhitzt. Die chromosomale DNA und die denaturierten Proteine werden abzentrifugiert. Die Plasmid-DNA kann vor der Präzipitation noch mittels Phenol-Chloroform-Extraktion gereinigt werden. Die in Wasser oder TE-Puffer gelöste DNA enthält noch RNA, weshalb eine photometrische Quantifizierung nicht sinnvoll ist. Schließt sich eine [[Gelelektrophorese|Gelanalyse]] an, wird der Probenpuffer mit RNase A versetzt.

== Alternative Verfahren ==
{{Hauptartikel|DNA-Reinigung}}
Weitere, generelle DNA-Reinigungsmethoden sind z. B. die [[Caesiumchlorid|CsCl]]-[[Dichtegradientenzentrifugation]].

== Belege ==
<references />

{{SORTIERUNG:Plasmidpraparation}}
[[Kategorie:Nukleinsäure-Methode]]
[[Kategorie:Molekularbiologie]]

Plasmidpräparation - Versionsgeschichte

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