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2021-12-14T19:12:15Z

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[[Datei:Plaque assay macro.jpg|mini|200px|Ungefärbte Plaques nach Färbung mit Methylenblau]]
[[Datei:Plaque assay dilution series.jpg|mini|200px|Plaque-Assay in verschiedenen Verdünnungsstufen des [[Herpes-simplex-Virus]]]]

Ein {{lang|en|'''Plaque-Assay'''}} (frz. {{lang|fr|''plaque''}} [plak] für „Platte; Fleck; Schild“; engl. {{lang|en|''assay''}}, s. [[Assay]]) ist ein Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung von infektiösen cytopathischen [[Viren]], bei dem eine zu untersuchende Probe in unterschiedlichen Verdünnungen in eine [[Zellkultur]] eingebracht wird.

== Prinzip ==
Aufgrund eines [[Cytopathischer Effekt|cytopathischen Effektes]] kommt es nach [[Infektion]] von Zellen mit Viruspartikeln (synonym ''[[Virion]]en'') zur [[Lyse (Biologie)|Lyse]] der Zellen und deren unmittelbaren Nachbarzellen. Nach Lyse dieser Zellen gelangen freigesetzte Viruspartikel wiederum in benachbarte Zellen, das Virus breitet sich dadurch immer weiter aus. So kommt es zu einem Fleck in einem zuvor [[Konfluenz (Zellkultur)|konfluenten]] Zellrasen, weil dort die Zellen lysiert wurden. Die Löcher im Zellrasen werden als ''Lysishof'' oder {{lang|fr|''Plaque''}} bezeichnet. Wird ein infizierter Zellrasen nach einer angemessenen Zeit, in der sich solche Plaques bilden konnten, fixiert und anschließend mit [[Methylenblau]], [[Kristallviolett]] oder [[Neutralrot]] gefärbt und gewaschen, so erkennt man die Plaques als leere, nicht gefärbte Stellen, von denen sich die toten, lysierten Zellen beim Waschen teilweise abgelöst haben.<ref>M. B. Gonzalez-Hernandez, J. Bragazzi Cunha, C. E. Wobus: ''Plaque assay for murine norovirus.'' In: ''Journal of visualized experiments : JoVE.'' Nummer 66, 2012, S. e4297, {{ISSN|1940-087X}}. {{DOI|10.3791/4297}}. PMID 22951568. {{PMC|3487293}}.</ref> Die Plaques werden (zum Teil vollautomatisiert) gezählt und zusammen mit dem bekannten eingesetzten Volumen und dem [[Verdünnungsfaktor]] wird die [[Konzentration (Chemie)|Konzentration]] an infektiösen Viruspartikeln in der untersuchten Probe ermittelt, typischerweise als Infektiöse Einheiten je Milliliter, IE/ml, oder {{lang|en|''plaque forming units''}} je Milliliter, PFU/ml.

Im Gegensatz zur Konzentrationsbestimmung von Viren im Blut oder Serum im Sinne einer [[Viruslast]] mittels Nachweis der viralen [[DNA]] oder [[RNA]] durch [[Polymerase-Kettenreaktion|PCR]] und eine evtl. vorangehende [[Reverse Transkription]], werden beim {{lang|en|Plaque-Assay}} inaktivierte oder nicht-infektiöse Partikel innerhalb einer Viruspopulation nicht erfasst. Der {{lang|en|Plaque-Assay}} ist daher ein direktes Maß für die Konzentration infektiöser Partikel in einer Probe. Da jedoch nicht alle auf die Zellen gegebenen infektiösen Virionen auch (nach der Virenzugabe und vor der Polymerzugabe) zu einer Infektion führen, und nicht alle Viruspartikel weit genug voneinander entfernt auf den Zellrasen gelangen, werden im {{lang|en|Plaque-Assay}} tendenziell zu niedrige Werte ermittelt.

Zur Verbesserung der Genauigkeit der Methode können die Zellen nach der Infektion mit einem [[Polymer]] (z. B. {{lang|en|''low-melting [[Agarose]]''}}<ref>C. R. Gaush, T. F. Smith: Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells. ''Appl Microbiol.'' 16(4):588-94 (1968). PMID 5647517.</ref> oder [[Zellulose]]pulver<ref>M. Matrosovich, T. Matrosovich, W. Garten, H. D. Klenk: New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. ''Virol J.'' 3:63 (2006). PMID 16945126.</ref>) überschichtet werden. Diese Beschichtung verhindert während der drei Tage des Versuchs bei Stößen oder Vibrationen eine ungewollte Infektion von Zellen über das [[Kulturmedium]] und erlaubt nur direkte Infektionen von Nachbarzellen, da sonst möglicherweise über das Medium Plaques von Tochtervirionen der folgenden Generationen entstehen können und eine zu hohe Konzentration ermittelt würde. Da ''low-melting-Agarose'' auf etwa 50 °C erhitzt werden muss, besteht im Vergleich bei Zellulosepulver kein Risiko, dass die Zellen erhitzt werden.

Bei Viren, die keinen cytopathischen Effekt aufweisen, kann die Viruskonzentration über die {{lang|en|''tissue culture infectious dose of 50 %''}} (TCID50, synonym ''cell culture infectious dose'', CCID50) bestimmt werden.<ref>Y. Gao, I. Nankya, A. Abraha, R. M. Troyer, K. N. Nelson, A. Rubio, E. J. Arts: Calculating HIV-1 Infectious Titre Using a Virtual TCID50 Method. ''Methods in Molecular Biology'' Vol. 485 Page 27-35 (2008). PMID 19020816.</ref> Diese Methode basiert auf der Infektion der Zellkultur und einem beliebigen Nachweis (z. B. [[Indirect immunoperoxidase assay]], [[Immunfluoreszenztest]], [[DNA-Extraktion]] mit [[Polymerase-Kettenreaktion|PCR]], [[RNA-Extraktion]] mit [[RT-PCR]]), ob eine Zellkultur nach einem längeren Zeitraum (z. B. sieben Tage) überhaupt infiziert ist. Die Bestimmung der TCID50 umgeht das Problem der Infektion durch Tochtervirionen durch die Vermeidung einer Zählung von Plaques, da nur die [[Grenzverdünnung]]en ermittelt werden, bei der noch eine Infektion stattfindet.

== Anwendungen ==
Mit dem {{lang|en|Plaque-Assay}} können nur Viruspartikel-Konzentration von Viren nachgewiesen werden, die eine verwendete [[Zelllinie]] infizieren können, darin replizieren und auch zur Lyse der Zellen führen wie z. B. [[Influenzavirus|Influenzaviren]] in [[MDCK-Zelle]]n.<ref>A. J. Eisfeld, G. Neumann, Y. Kawaoka: ''Influenza A virus isolation, culture and identification.'' In: ''Nature protocols.'' Band 9, Nummer 11, November 2014, S. 2663–2681, {{DOI|10.1038/nprot.2014.180}}, PMID 25321410.</ref> Der {{lang|en|Plaque-Assay}} kann bei [[Lytischer Zyklus|lytischen Viren]] auch zur Bestimmung der [[Viruslast]], eines [[Virustiter]]s oder der [[Minimale Infektionsdosis|minimalen Infektionsdosis]] verwendet werden.

Der {{lang|en|Plaque-Assay}} kann neben der Bestimmung der Konzentration infektiöser Virionen auch in einem [[Neutralisationstest|''Virus-Neutralisations-Assay'']] (synonym Plaque-Reduktions-Assay) zum Nachweis [[Neutralisierende Antikörper|infektionshemmender Antikörper]] gegen Teile des [[Virion]]s dienen. Dafür werden Viren in bekannter Konzentration mit einer auf neutralisierende Antikörper zu testenden Probe vorher inkubiert und anschließend auf die Zellen gegeben. Binden die Antikörper an jene Oberflächen[[epitope]] der Viren, die zur Aufnahme in die Zelle notwendig sind, so sieht man im {{lang|en|Plaque-Assay}} eine Verringerung der PFU/mL im Vergleich zu einer [[Negativkontrolle]] ohne diese Antikörper.<ref>M. de Graaf, S. Herfst, E. J. Schrauwen et al.: An improved plaque reduction virus neutralization assay for human metapneumovirus. ''J Virol Methods'' 143(2): S. 169–74 (2007). PMID 17420056.</ref>

Der Plaque-Assay wird auch genutzt, um die Wirkung von Desinfektionsmitteln zu untersuchen, bei denen das virale [[Genom]] nicht beeinträchtigt wird und unverändert nachweisbar bleibt, hingegen die Infektiosität der [[Virion]]en reduziert wird. Mit dem {{lang|en|Plaque-Assay}} kann auch untersucht werden, wie hoch die Konzentration von infektiösen Viren in einer gesammelten Probe oder nach einer Virusanzucht im Zellkulturmedium ist. Bei vielen Viren (insbesondere [[RNA-Virus|RNA-Viren]]) ist nur ein geringer Prozentsatz der freigesetzten Virionen auch tatsächlich infektiös.

Der Vorläufer des {{lang|en|Plaque-Assays}} erfasste bei [[Influenzavirus|Influenzaviren]] anhand der Veränderung des [[Amnion]]s infizierter [[embryoniertes Hühnerei|embryonierter Hühnereier]] die Anzahl {{lang|en|''focus forming units''}} pro Milliliter.

== Literatur ==
* H. L. Bachrach, J. J. Callis et al.: ''A plaque assay for foot-and-mouth disease virus and kinetics of virus reproduction''. Virology (1957) 4(2): S. 224–36 PMID 13496542
* P. D. Cooper: ''The plaque assay of animal viruses''. Adv Virus Res (1961) 8: S. 319–78 PMID 13881155

== Einzelnachweise ==
<references />

[[Kategorie:Virologische Diagnostik]]
[[Kategorie:Zellkulturmethode]]

Plaque-Assay - Versionsgeschichte

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