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Das '''Phagen-Display''' ({{enS|''phage display''}}) ist eine [[Biotechnologie|biotechnologische]] Methode, bei der aus großen [[Rekombinantes Protein|rekombinanten]] Bibliotheken [[Peptid]]e, Proteinteile (z. B. [[Antikörper]]fragmente) oder komplette [[Protein]]e funktionell auf der Oberfläche von [[Bakteriophagen]] präsentiert werden, um anschließend geeignete Bindepartner für einen bestimmten [[Ligand (Biochemie)|Liganden]] zu isolieren und zu identifizieren. Das Phagen-Display ist für die Aufklärung von [[Protein-Protein-Interaktion]]en, für die Entwicklung neuer biologischer [[Arzneistoff]]e und für die Suche nach spezifischen Antikörpern für therapeutische, diagnostische oder experimentelle Anwendungen von großer Bedeutung.

Die Methode wurde als erste Form einer [[Molekulares Display|molekularen Display-Technik]] von [[George P. Smith]] 1985 eingeführt.<ref>{{Literatur |Autor=G. P. Smith |Titel=Filamentous Fusion Phage: Novel Expression Vectors That Display Cloned Antigens on the Virion Surface |Sammelwerk=[[Science]] |Band=228 |Nummer=4705 |Datum=1985-06-14 |Seiten=1315–1317 |DOI=10.1126/science.4001944}}</ref> Dieser erhielt dafür 2018 den [[Nobelpreis für Chemie]], zusammen mit [[Greg Winter]], der die Technik so weiterentwickelte, dass auch Teile menschlicher Antikörper im Phagen-Display präsentiert werden.

== Prinzip ==
[[Datei:Phage display.svg|mini|Allgemeines Schema des ''In-vitro''-Biopannings als zentrales Element des Phagen-Displays]]

Das Prinzip des molekularen Displays basiert auf dem gemeinsamen Vorkommen eines [[Protein]]s und seiner codierenden [[DNA]] in einem [[Teilchen#Verwandte Begriffe|Partikel]] (in diesem Falle sind es [[Bakteriophagen]]), wodurch anhand der Bindung an ein bereits vorliegendes Protein (oder anderes Molekül) ein Interaktionspartner aus einer Mischung von transgenen Bakteriophagen isoliert werden kann, dessen DNA dann ebenso vorliegt. Die dem rekombinanten Oberflächenprotein entsprechende DNA-Sequenz wird anschließend extrahiert, per [[Polymerasekettenreaktion|PCR]] vervielfältigt und per [[DNA-Sequenzierung]] sequenziert. Über den [[Genetischer Code|genetischen Code]] ist dann auch die [[Aminosäuresequenz]] des bindenden Proteins bekannt.

Beim Phagen-Display werden meistens parallel jeweils mehrere beliebige DNA-Sequenzen an die DNA-Sequenz eines [[Hüllprotein]]s im [[Genom]] des Bakteriophagen oder in einem [[Phagemid]] [[Ligation|ligiert]], so dass die in dieser Sequenz [[Codon|codierten]] Proteine oder [[Peptid]]e [[N-Terminus|N-terminal]] als [[Fusionsprotein]] auf der Oberfläche des Bakteriophagen präsentiert werden. Die Präsentation der Proteine auf der Oberfläche erlaubt eine [[Selektion (Evolution)|Selektion]] der Phagen nach der [[Affinität (Biochemie)|Affinität]] zu einem bestimmten Molekül. Dadurch können aus beliebigen Mischungen an DNA-Sequenzen rekombinante Bakteriophagen erzeugt und isoliert werden, die aufgrund ihres Fusionsproteins an ein Molekül binden können, für das ein Interaktionspartner gesucht wird.

Das Phagen-Display kann mit filamentösen Phagen (Familie ''[[Inoviridae]]'', z. B. Gattung ''[[Inovirus]]'' mit den f1-Phagen, M13-Phagen oder fd-Phagen), mit [[Escherichia-Virus T4|T4-]] und [[Enterobacteria-Phage T2|T6-Phagen]] ([[Myoviren]]), mit [[Bakteriophage Lambda|λ-Phagen]] ([[Siphoviren]]) oder mit [[Escherichia-Virus T7|T7-Phagen]] ([[Podoviren]]) durchgeführt werden.<ref name="PMID 19885657">W. Li, N. B. Caberoy: ''New perspective for phage display as an efficient and versatile technology of functional proteomics.'' In: ''Applied Microbiology and Biotechnology.'' 2010, Band 85, Nr. 4, S. 909–919. PMID 19885657, {{PMC|2992952}}.</ref> Dementsprechend wird bei filamentösen Phagen meistens das Protein g3p (synonym pIII, ''{{lang|en|minor coat protein}}'', s. u.), seltener wird auch pVI, pVII, pVIII (''{{lang|en|major coat protein}}'', MCP) oder pIX als Fusionspartner an der Virusoberfläche verwendet,<ref>J. W. Kehoe, B. K. Kay: ''Filamentous phage display in the new millennium.'' In: ''[[Chemical Reviews]]'' 2005, Band 105, Nr. 11, S. 4056–72, PMID 16277371.</ref> bei T4-Phagen werden meistens Soc oder Hoc als Fusionsprotein eingesetzt.<ref>V. B. Rao, L. W. Black: ''Structure and assembly of bacteriophage T4 head.'' In: ''Virology Journal.'' 201, Band 7, S. 356, PMID 21129201, {{PMC|3012670}}.</ref>

Der Zusammenbau der Bakteriophagen erfolgt in [[Bakterien]]. Virale [[Membranprotein]]e müssen zum Zusammenbau eines filamentösen Phagen zuerst in die bakterielle [[Zellmembran]] eingelagert werden, um sich dort mit dem [[Kapsid]] zusammenzulagern. Bei Bakterien gibt es hierzu drei Systeme der [[Sekretion]] von Membranproteinen, das [[Sec-System]], das [[Signalerkennungspartikel|SRP]]-System und das [[Twin Arginine Translocation|TAT]]-System. Die Verwendung von [[Lytischer Zyklus|lytischen]] Phagen wie T4-, T6-, [[Escherichia-Virus T7|T7-]] oder λ-Phagen erfordert dagegen keine Einlagerung viraler Proteine in die Zellmembran.<ref name="PMID 19885657" />

Das Sec- und das SRP-System entfalten ein Protein zur [[Posttranslationaler Proteintransport|Translokation]] durch die Zellmembran. Dagegen ist das TAT-System leichter zu [[Enzymkinetik|sättigen]], aber es kann [[Proteinfaltung|gefaltete Proteine]] von bis zu 180 [[Kilodalton]] durch die Membran schleusen. Zudem kann im TAT-System die Proteinfaltung bereits in der [[Reduktion (Chemie)|reduzierenden]] Umgebung des [[Zytosol]]s erfolgen, was bei zytosolischen Proteinen für eine korrekte Faltung notwendig sein kann, denn außerhalb der Zellmembran (im [[Periplasma]]) können sich unerwünschte [[Disulfidbrücke]]n ausbilden, die eine korrekte Faltung verhindern können.<ref>N. Velappan, H. E. Fisher, E. Pesavento, L. Chasteen, S. D’Angelo, C. Kiss, M. Longmire, P. Pavlik, A. R. Bradbury: ''A comprehensive analysis of filamentous phage display vectors for cytoplasmic proteins: an analysis with different fluorescent proteins.'' In: ''[[Nucleic Acids Research]].'' 2010, Band 38, Nr. 4, S. e22, PMID 19955231, {{PMC|2831335}}.</ref><ref>J. Speck, K. M. Arndt, K. M. Müller: ''Efficient phage display of intracellularly folded proteins mediated by the TAT pathway.'' In: ''Protein Engineering, Design and Selection.'' 2011, Band 24, Nr. 6, S. 473–84, PMID 21289038, [http://peds.oxfordjournals.org/content/24/6/473.long PDF].</ref> Bei den lytischen Phagen besteht kein Problem mit Disulfidbrücken-verursachter Proteinfehlfaltung, da sie im Zytosol zusammengebaut werden, wo aufgrund der reduzierenden Umgebung keine Disulfidbrücken entstehen können.<ref>J. Rakonjac, N. J. Bennett, J. Spagnuolo, D. Gagic, M. Russel: ''Filamentous bacteriophage: biology, phage display and nanotechnology applications.'' In: ''Current Issues in Molecular Biology.'' 2011, Band 13, Nr. 2, S. 51–76, PMID 21502666, [http://www.horizonpress.com/cimb/v/v13/51.pdf PDF].</ref>

=== Phagen-Display von Antikörper-Bibliotheken ===
Zunächst werden Antikörper-produzierende B-Zellen (Plasmazellen) aus dem Blut, Knochenmark oder Lymphknoten eines Spenders isoliert. Daraus wird die [[mRNA]] gewonnen und in [[cDNA]] umgeschrieben. Mit Hilfe der [[Polymerase-Kettenreaktion]] (PCR) werden aus der cDNA die [[Gen]]e der leichten (VL) und schweren Kette (VH) der Antikörper vervielfältigt. Jeder Gensatz (VL ''und'' VH) wird mit dem verkürzten Gen des Hüllproteins pIII (''{{lang|en|minor coat protein}}'', mCP) des M13-[[Phagen]] (Gattung ''[[Inovirus]]'') in einem speziellen [[Phagemid|Phagemid-Vektor]] [[Ligation|ligiert]] und ''[[Escherichia coli]]'' damit [[Transformation (Genetik)|transformiert]]. Dadurch exprimieren die ''E. coli'' Bakterien pIII-[[Fusionsprotein]]e<ref>{{cite journal |author=B. Braun, M. Paschke|title=Phagen-Display auf neuen Wegen |journal=Biospektrum |volume=Band 12 |issue=4 |year=2006 |pages=381–383 |url=http://www.biospektrum.de/blatt/d_bs_pdf&_id=932676}}</ref> mit [[scFv-Fragment]]en oder [[Fab-Fragment|Fab-Antikörperfragmenten]]. Die Fusionsproteine werden durch ein [[Signalpeptid]] (aus [[pelB]] oder [[ompA]] stammend) ins [[Periplasma]] transportiert, dort falten sie sich zu einem funktionalen scFv bzw. durch Disulfidbrücke verbundenem Fab-Fragment. Die Fv- bzw. Fab-Anteile bleiben zunächst über das pIII-Fragment in der inneren ''E. coli''-Membran verankert und binden beim Abschluss des Zusammenbaus des Phagen an das Kapsid.

Über das Hüllprotein pIII, das normalerweise für die Infektion der Bakterien verantwortlich ist, wird nach Koinfektion mit einem M13-Helferphagen (für die Expression des nicht modifizierten pIII und die anderen Phagenproteine) das funktionale Antikörperfragment beim Reifungsprozess neugebildeter Phagen in deren Außenhülle eingebaut. Gleichzeitig wird der Phagemid mit der zugehörigen genetischen Information für das entsprechende Antikörperfragment ins Innere der neugebildeten Phagen eingebaut. Jeder dieser [[Rekombinante DNA|rekombinanten]] Phagen hat also theoretisch ein anderes Antikörperfragment auf seiner Oberfläche und gleichzeitig die zugehörigen Gene (VL und VH) in seinem Inneren, vergleichbar mit den Milliarden von B-Zellen im (menschlichen) Körper.

In einem sogenannten ''Biopanning'' können die „bindenden“ Phagen über die auf der Oberfläche exponierten Antikörperfragmente durch Wechselwirkung mit fixierten Liganden ([[Antigen]]en) aus dem milliardenfachen Hintergrund der irrelevanten Phagen ([[Genbibliothek]]) herausgefischt werden.

Aus den so isolierten, „monoklonalen“ Antikörper-Phagen können die zugehörigen Antikörpergene einfach isoliert und [[DNA-Sequenzierung|sequenziert]] werden. Ebenso können damit die selektierten Antikörper-Fragmente als lösliche Proteine für spezielle Anwendungen in Massenkultur in ''E. coli'' oder anderen Zellsystemen produziert werden.

=== Phagen-Display von Peptid-Bibliotheken ===
In gleicher Weise wie mit Antikörpern ist es möglich, Peptidsequenzen (9 bis 12 [[Aminosäure]]reste) anhand ihrer Affinität zu bestimmten Zielmolekülen zu selektieren.

Diese Technik ist sinnvoll, um kleine Moleküle zu selektieren, die sich später als Medikamente einfacher als größere Moleküle wie z. B. Antikörper oder andere Proteine einsetzen lassen.

Eine andere Anwendungsmöglichkeit für Peptid-Bibliotheken ist auch die Bestimmung von [[Epitop]]sequenzen bei monoklonalen Antikörpern.

=== Phagen-Display von cDNA-Bibliotheken ===
Bisher wenig verwendet ist auch die Darstellung von [[cDNA]]-Expressionsbibliotheken auf Phagen. Da in den
Sequenzen vieler Bibliotheken häufig [[Stopcodon]]s vorkommen, ist es nicht möglich, die Sequenzen der Bibliothek vor das pIII-Protein filamentöser Phagen zu verbinden.

Daher werden als Alternative lytische Phagen oder die als [[Jun/Fos-System]] bezeichnete nicht-kovalente Zusammenlagerung des Proteins aus der eingefügten DNA-Sequenz und pIII von filamentösen Phagen verwendet.<ref name="PMID 19885657" /> Im Jun/Fos-System wird zunächst Jun an das pIII-Protein gekoppelt. Auf dem gleichen [[Phagemid]] wird Fos vor die zu [[Genexpression|exprimierenden]] Sequenzen gesetzt. Da beide Proteine auf einem Phagemid enthalten sind, werden beide Proteine gleichzeitig exprimiert, Jun und Fos [[dimer]]isieren über ihre [[Leucin-Zipper]] und koppeln auf diese Weise das pIII-Protein an die exprimierte cDNA-Sequenz.<ref name="pmid7957259">{{Literatur |Autor=Reto Crameri, Rolf Jaussi, Günter Menz, Kurt Blaser |Titel=Display of Expression Products of cDNA Libraries on Phage Surfaces |Sammelwerk=[[European Journal of Biochemistry]] |Band=226 |Nummer=1 |Datum=1994-11-01 |Seiten=53–58 |DOI=10.1111/j.1432-1033.1994.00t53.x}}</ref>

== Anwendungen und Perspektiven ==
Das Phagen-Display ist eine Technik, die auf Protein-Protein-Interaktionen beruht und sich daher als Methode zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen Proteinen eignet.<ref name="pmid12512072">{{Literatur |Autor=Sachdev S. Sidhu, Wayne J. Fairbrother, Kurt Deshayes |Titel=Exploring Protein–Protein Interactions with Phage Display |Sammelwerk=[[ChemBioChem]] |Band=4 |Nummer=1 |Datum=2003-01-03 |Seiten=14–25 |DOI=10.1002/cbic.200390008}}</ref> Display-Techniken ermöglichten erstmals die Herstellung und Charakterisierung vieler neuer humaner Antikörper. Auch andere Proteine, z. B. in Form von cDNA-Bibliotheken, lassen sich im Phagen-Display selektieren. Die Affinität der selektierten Antikörper kann durch Mutagenese erhöht werden. In den letzten Jahren hat es viele Verbesserungen der Techniken gegeben, aber Phagen-Display ist noch längst nicht Routine. Mehrere Firmen bieten inzwischen an, aus sehr großen, z. T. semisynthetischen Phagen-Display-Bibliotheken Antikörper gegen nahezu jedes beliebige Antigen zu produzieren. Rekombinante Antikörper machen ca. 30 % aller derzeit in der klinischen Prüfung befindlichen [[Biopharmazeutikum|Biopharmazeutika]] aus; das zeigt, welches Potential für das Wachstum der [[Biotechnologie]] in der Produktion dieser Produkte steckt.

== Literatur ==
* {{Literatur
|Autor=Thomas Schirrmann, Michael Hust, Stefan Dübel
|Titel=Die Antikörperfabrik: Antikörper für jedes Protein
|Sammelwerk=[[Biologie in unserer Zeit]]
|Band=37
|Nummer=6
|Datum=2007-12-01
|Seiten=348–351
|DOI=10.1002/biuz.200790096}}
* {{Literatur
|Autor=Hennie R. Hoogenboom
|Titel=Selecting and screening recombinant antibody libraries
|Sammelwerk=[[Nature Biotechnology]]
|Band=23
|Nummer=9
|Datum=2005-09-07
|Seiten=1105–1116
|Kommentar=Review
|DOI=10.1038/nbt1126}}
* A. Schmiedl, S. Dübel: ''Rekombinante Antikörper & Phagen-Display'' In: M. Wink. (Hrsg.): ''Molekulare Biotechnologie.'' Wiley-VCH. 2004.
* {{Literatur
|Autor=Valery A Petrenko, Iryna B Sorokulova
|Titel=Detection of biological threats. A challenge for directed molecular evolution
|Sammelwerk=Journal of Microbiological Methods
|Band=58
|Nummer=2
|Datum=2004-08
|Seiten=147–168
|DOI=10.1016/j.mimet.2004.04.004}}
* {{Literatur
|Autor=Peter J. Hudson, Christelle Souriau
|Titel=Engineered antibodies
|Sammelwerk=Nature Medicine
|Band=9
|Nummer=1
|Datum=2003-01-01
|Seiten=129–134
|Kommentar=Review
|DOI=10.1038/nm0103-129}}
* R. Konterman, S. Dübel: ''Antibody Engineering'' (= ''Springer Lab Manual.'') Springer, Berlin / Heidelberg 2001, ISBN 3-662-04605-9.
* F. Breitling, S. Dübel: ''Rekombinante Antikörper. Labor im Focus.'' Akademie-Verlag, Berlin 1997, {{OCLC|299950268}}.
* P. Fischer: ''Expression des humanen Antikörperrepertoirs mit Bakteriophagen: Techniken, Anwendungen und Perspektiven.'' In: ''Biospektrum.'' Band 2, 1996, S. 26–29 (Review).

== Weblinks ==
{{Commonscat|Phage display|Phagen-Display}}
* [http://www.nature.com/nbt/journal/v23/n9/fig_tab/nbt1126_F2.html Creating and selecting recombinant antibody libraries] Übersichtsgrafik (englisch)
* [http://www.scripps.edu/mb/barbas/content/pcomb_images/updatepcomb_image.htm pComb3-Vektoren für Phagen-Display] Webseite über pComb3-Vektoren (englisch)

== Einzelnachweise ==
<references />

[[Kategorie:Protein-Protein-Interaktionsbestimmung]]
[[Kategorie:Biotechnologie]]
[[Kategorie:Mikrobiologie]]

Phagen-Display - Versionsgeschichte

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