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2024-06-16T07:07:23Z

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'''Ligation-During-Amplification''' ('''LDA''') ist eine [[Molekularbiologie|molekularbiologische]] Methode zur linearen [[Amplifikation (Genetik)|Amplifikation]] von zirkulärer [[Desoxyribonukleinsäure|DNA]] (zum Beispiel einem [[Plasmid]]) in einem [[Polymerase-Kettenreaktion|PCR]]-basierten Verfahren. Dabei werden ein oder mehrere sequenzspezifische [[Primer]]paare mit den einzuführenden Sequenzveränderungen, eine [[thermostabile DNA-Polymerase]] sowie eine thermostabile [[DNA-Ligase]] verwendet.<ref>Z. Chen, D. E. Ruffner: ''Amplification of closed circular DNA in vitro''. In: ''[[Nucleic Acids Research]]'', Band 26, 1998, S. 1126–1127, PMID 9461478, {{PMC|147341}}</ref><ref>A. R. Shenoy, S. S. Visweswariah: ''Site-directed mutagenesis using a single mutagenic oligonucleotide and DpnI digestion of template DNA.'' In: ''[[Anal. Biochem.]]'' Band 319, 2003, S. 335–336. PMID 12871732 [[doi:10.1016/S0003-2697(03)00286-0]]</ref><ref>A. Sawano, A. Miyawaki: ''Directed evolution of green fluorescent protein by a new versatile PCR strategy for site-directed and semi-random mutagenesis''. In: ''[[Nucleic Acids Research]]'', Band 28, 2000, S. E78. PMID 10931937, {{PMC|108465}}</ref> Diese Methode wird auch als ''QuikChange Multi'' von Stratagene vermarktet.<ref>QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit. {{Webarchiv |url=http://www.stratagene.com/manuals/200514.pdf |wayback=20060523015351 |text=Manual |format=PDF}}</ref>

Diese Methode wird genutzt zur gezielten [[Mutagenese]] von Plasmiden im Zuge einer gewünschten Anpassung des [[Vektor (Gentechnik)|Vektors]] oder der [[Expressionskassette]] im Zuge des [[Proteindesign]]s.
Dabei wird mit einem mutagenen Primer ein Strang der zirkulären Plasmid-DNA (Template) in einem [[Thermocycler]] in mehreren Zyklen ''linear'' amplifiziert und ligiert. Anschließend wird die parentale, methylierte Plasmid-DNA (Template) mit dem [[Restriktionsenzym]] ''Dpn''I, welches nur ''dam'' [[DNA-Methylierung|methylierte DNA]] spaltet, abgebaut. Danach wird die amplifizierte, mutierte, einzelsträngige, zirkuläre DNA in Bakterien transformiert und dort zur doppelsträngigen Plasmid-DNA vervollständigt.

Eine weitere Methode basiert auf der Umkehrung des Prinzips. Hierzu wird zur Amplifikation Hydroxymethyl-Desoxycytidin (HMdCTP) anstelle des dCTPs gegeben und anschließend mit einer Mischung aus den Restriktionsendonukleasen ApeK1 und Pho1 in einem [[Katalysatoraktivität|Aktivitätsverhältnis]] von 2:1 restringiert. Dadurch wird nur die DNA-Vorlage (ohne Hydroxymethyl-Desoxycytidine) zerlegt. Die Ligation erfolgt nach der [[Transformation (Genetik)|Transformation]] ''in vivo''.

== Literatur ==
<references />

== Weblinks ==
* {{Webarchiv |url=http://www.med.jhu.edu/medcenter/primer/primer.cgi |wayback=20090122150440 |text=The Primer Generator}} – Automated generator of primers for site-directed mutagenesis
* [http://bioinformatics.org/primerx/ PrimerX] – Automated design of mutagenic primers for site-directed mutagenesis

[[Kategorie:Molekularbiologie]]
[[Kategorie:Mutation]]
[[Kategorie:Biochemisches Nachweisverfahren]]
[[Kategorie:Nukleinsäure-Methode]]

Ligation-During-Amplification - Versionsgeschichte

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