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Der '''In-Gel-Verdau''' ist Bestandteil der [[Probenvorbereitung (Massenspektrometrie)|Probenvorbereitung]] zur [[Massenspektrometrie|massenspektrometrischen]] [[Analyse]] von [[Protein]]en im Rahmen von [[Proteomik|Proteomanalysen]]. Der In-Gel-Verdau umfasst im Wesentlichen die vier Schritte Entfärbung, [[Reduktion (Chemie)|Reduktion]] und [[Alkylierung]] (R&A) der in den Proteinen enthaltenen [[Cystein]]e, proteolytische Spaltung der Proteine und [[Gelextraktion]] der erzeugten [[Peptid]]e.

Die Methode wurde 1992 von Rosenfeld ''et al.'' eingeführt.<ref name="Rosenfeld, J et al, 1992">J. Rosenfeld, J. Capdevielle, J. C. Guillemot, P. Ferrara: ''In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis.'' In: ''[[Analytical Biochemistry]]'' (1992), Band 203, Ausgabe 1, S. 173–179. PMID 1524213.</ref> Trotz unzähliger Veränderungen und Verbesserungen des Verfahrens haben sich die grundlegenden Bestandteile bis heute weitgehend erhalten.<ref name="Jeno, P et al, 1995">P. Jenö, T. Mini, S. Moes, E. Hintermann, M. Horst: ''Internal sequences from proteins digested in polyacrylamide gels.'' In: ''Anal Biochem.'' (1995), Band 224, Ausgabe 1, S. 75–82. PMID 7710119.</ref><ref name="Shevchenko, A et al, 1996">A. Shevchenko, M. Wilm, O. Vorm, M. Mann: ''Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.'' In: ''Analytical Chemistry'' (1996), Band 68, Ausgabe 5, S. 850–858. PMID 8779443.</ref><ref name="Borchers, C et al, 2000">C. Borchers, J. F. Peter, M. C. Hall, T. A. Kunkel, K. B. Tomer: ''Identification of in-gel digested proteins by complementary peptide mass fingerprinting and tandem mass spectrometry data obtained on an electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometer.'' In: ''Anal Chem.'' (2000), Band 72, Ausgabe 6, S. 1163–1168. PMID 10740854.</ref><ref name="Shevchenko, A et al, 2006">A. Shevchenko, H. Tomas, J. Havlis, J. V. Olsen, M. Mann: ''In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.'' In: ''Nature Protocols'' (2006), Band 1, Ausgabe 6, S. 2856–2860. PMID 17406544.</ref><ref name="Granvogl, B et al, 2007">B. Granvogl, P. Gruber, L. A. Eichacker: ''Standardisation of rapid in-gel digestion by mass spectrometry.'' In: ''Proteomics'' (2007), Band 7, Ausgabe 5, S. 642–654. PMID 17340585.</ref>

== Prinzip ==
=== Entfärbung ===
Nach dem Ausschneiden der mittels 1D bzw. 2D [[Polyacrylamid-Gelelektrophorese|PAGE]] separierten und mit [[Farbstoff]]en (zum Beispiel [[Coomassie-Brillant-Blau]] (CBB) oder [[Silberfärbung|Silber]]) visualisierten Proteinbanden bzw. -spots erfolgt eine Entfärbung der [[Protein]]e. Die Verwendung von Coomassie zur Visualisierung von Proteinen bereitet die wenigsten Probleme in der nachfolgenden [[Massenspektrometrie|massenspektrometrischen]] [[Analyse]]. Deshalb ist die Methode trotz ihrer geringeren [[Empfindlichkeit (Analytik)|Sensitivität]] weit verbreitet.

Die Entfärbelösung für CBB enthält in der Regel das [[Pufferlösung|Puffer]]-[[Salze|Salz]] [[Ammoniumhydrogencarbonat]] (NH4HCO3) und einen Anteil von 30–50 % [[Organische Chemie|organisches]] [[Lösungsmittel]] (meist [[Acetonitril]]). Die [[Hydrophober Effekt|hydrophoben Wechselwirkungen]] zwischen Protein und Coomassie-Farbstoff werden im organischen Lösungsmittel herabgesetzt.<ref>Y. Jin, T. Manabe, in: ''[[Electrophoresis]]'' '''2005''', ''26'', 1019–1028.</ref> Zugleich reduziert der Salzanteil die [[Elektrostatik|elektrostatischen]] Interaktionen zwischen den [[Farbstoff]]molekülen und den positiv geladenen [[Aminosäuren]] der Proteine. Im Vergleich zu einem Gemisch aus [[Wasser]] und organischem Lösungsmittel wird die Effektivität der Entfärbung verbessert. Eine Erhöhung der [[Temperatur]] begünstigt den Entfärbungsprozess.<ref>M. D. Lloyd, in: ''[[Analytical Biochemistry|Anal. Biochem.]]'' '''1996''', ''241'', 139–40.</ref> Die Entfärbung ist meist mit einem Verlust von unter zehn Prozent des Proteins verbunden.<ref name="Speicher, KD et al, 2000">K. D. Speicher, in: ''[[Journal of Biomolecular Techniques|J. Biomol. Tech.]]'' '''2000''', ''11'', 74–86.</ref> Zudem verbessert die Entfernung des Farbstoffs grundsätzlich nicht die [[Peptid]]ausbeute.<ref name="Granvogl, B et al, 2007" /><ref>D. E. Terry, in: ''[[Journal of the American Chemical Society of Mass Spectrometry]]'' '''2004''', ''15'', 784–94.</ref>

Im Falle [[Silberfärbung|silbergefärbter]] Banden erfolgt die Entfärbung durch die [[Oxidation]] des an die Proteine angelagerten [[metall]]ischen [[Silber]]s mit Hilfe von [[Kaliumhexacyanidoferrat(III)]] oder [[Wasserstoffperoxid]] (H2O2).<ref>F. Gharahdaghi, in: ''[[Electrophoresis]]'' '''1999''', ''20'', 601–5.</ref><ref>L. W. Sumner, in: ''[[Rapid Communications in Mass Spectrometry|Rapid Commun. Mass Spectrom.]]'' '''2002''', ''16'', 160–8.</ref> Die freiwerdenden [[Schwermetall]][[ion]]en werden nachfolgend mit [[Natriumthiosulfat]] [[Komplexbindung|komplexiert]].

=== Reduktion und Alkylierung ===
An die Färbung und Entfärbung der Proteine wird oft eine Reduktion und Alkylierung der potentiell enthaltenen [[Cystin]]e bzw. [[Cystein]]e angeschlossen. Dabei werden die [[Disulfidbrücke]]n des Proteins getrennt und damit eine optimale Entfaltung des Proteins erreicht. Die [[Reduktion (Chemie)|Reduktion]] zum [[Alkanthiol|Thiol]] wird über die Reaktion mit Chemikalien erreicht, die Sulfhydryl- oder Phosphingruppen (zum Beispiel [[Dithiothreitol]] (DTT) oder [[Tris-2-Carboxyethylphosphin-Hydrochlorid]] (TCEP)) enthalten. Im Zuge der nachfolgenden irreversiblen Alkylierung der SH-Gruppen mit [[Iodacetamid]] werden die Cysteine in das stabile S-Carboxyamidomethylcystein (CAM; Addukt: -CH2-CONH2) übergeführt. Damit erhöht sich die spezifische Masse für die [[Aminosäure]] Cystein von 103,01 auf 160,03 [[Dalton (Einheit)|Da]].

Durch die Modifikation wird bei Proteinen mit einer hohen Anzahl an Disulfidbrücken die Identifikation und eine maximale Peptidausbeute und [[Aminosäuresequenz|Sequenzabdeckung]] sichergestellt.<ref>J. E. Hale, in: ''[[Analytical Biochemistry|Anal. Biochem.]]'' '''2004''', ''333'', 174–81.</ref><ref>H. Katayama, in ''[[Rapid Communications in Mass Spectrometry|Rapid Commun. Mass Spectrom.]]'' '''2004''', ''18'', 2388–2394.</ref> Wegen der relativen Seltenheit der [[Aminosäure]] Cystein bringt dieser Schritt für einen großen Teil der Proteine keine deutliche Verbesserung.<ref name="Borchers, C et al, 2000" /><ref name="Speicher, KD et al, 2000" /><ref name="Havlis, J et al, 2003">J. Havlis, in: ''[[Analytical Chemistry|Anal. Chem.]]'', '''2003''', ''75'', 1300–6.</ref><ref>A. Shevchenko, in: ''[[Analytical Biochemistry|Anal. Biochem.]]'', '''2001''', ''296'', 279–83.</ref> Für eine [[quantitativ]]e und homogene Alkylierung der Cysteine ist der Zeitpunkt der Modifikation entscheidend. Bei der denaturierenden [[Elektrophorese]] bietet es sich an, die Reaktion vor der Trennung durchzuführen, da freie [[Acrylamid]]-[[Monomere]] ebenfalls Cysteine modifizieren können.<ref>M. Hamdan, in: ''[[Electrophoresis]]'' '''2001''', ''22'', 1633–1644.</ref><ref>R. Mineki, in: ''[[Proteomics (Zeitschrift)|Proteomics]]'' '''2002''', ''2'', 1672–1681.</ref><ref>S. Sechi, B. T. Chait, in: ''[[Analytical Chemistry|Anal. Chem.]]'' '''1998''', ''70'', 5150–8.</ref><ref>B. Herbert, in: ''[[Electrophoresis]]'' '''2001''', ''22'', 2046–2057.</ref> Die entstehenden Acrylamid-[[Addukt]]e werden ebenfalls irreversibel an die Cysteine gebunden. Die spezifische Masse des Addukts beträgt 174,05 Da.

=== In-Gel-Verdau ===
Anschließend erfolgt der für die Methode namensgebende Schritt, der In-Gel-Verdau des [[Protein]]s. Das Protein wird hierbei [[enzym]]atisch in eine definierte Anzahl kürzerer Fragmente mit charakteristischer Masse (Peptide) gespalten, die zu seiner Identifikation verwendet werden können. Die [[Serinprotease]] [[Trypsin]] ist dabei die in der [[Proteomik|Proteomanalytik]] am weitesten verbreitete Protease. Trypsin spaltet [[Peptidbindung]]en spezifisch am [[Carboxy]]ende der [[Base (Chemie)|basischen]] [[Aminosäure]]n [[Arginin]] und [[Lysin]]. Befindet sich unmittelbar benachbart zur Schnittstelle eine [[PH-Wert|saure]] Aminosäure ([[Aspartat]] oder [[Glutaminsäure|Glutamat]]), wird die [[Hydrolyse]]rate eingeschränkt. Keine Spaltung erfolgt bei einem C-terminal zur Schnittstelle gelegenen [[Prolin]].<ref>B. Thiede, in: ''[[Rapid Communications in Mass Spectrometry|Rapid Commun. Mass Spectrom.]]'' '''2000''', ''14'', 496–502.</ref>

Als unerwünschter Nebeneffekt tritt beim proteolytischen Verdau der Eigenverdau der Protease auf. Um dies zu verhindern wurden dem Verdaupuffer früher [[Calcium|Ca2+]]-Ionen zugesetzt.<ref>T. Vajda, A. Garai, in: ''[[Journal of Inorganic Biochemstry|Inorg. Biochem.]]'' '''1981''', ''15'', 307–15.</ref><ref>T. Sipos, J. R. Merkel, in: ''[[Biochemistry]]'' '''1970''', ''9'', 2766–2775.</ref> Heute wird von den meisten Herstellern modifiziertes Trypsin angeboten. Durch selektive [[Methylierung]] der im Trypsin enthaltenen Lysine kann der Eigenverdau auf dessen argininhaltige Peptide beschränkt werden.<ref>R. H. Rice, in: ''[[Biochimica et Biophysica Acta|BBA]]'' '''1977''', ''492'', 316–321.</ref> Unmodifiziertes Trypsin hat seine höchste Aktivität zwischen 35 und 45 °C. Nach der Modifikation verschiebt sich das Temperaturoptimum auf 50 bis 55 °C.<ref name="Havlis, J et al, 2003" /><ref>E. J. Finehout, in: ''[[Proteomics (Zeitschrift)|Proteomics]]'' '''2005''', ''5'', 2319–2321.</ref> Neben Trypsin finden unter anderem die Endoproteasen Lys-C,<ref name="Michalski, WP und Shiell, BJ, 1999">W. P. Michalski, B. J. Shiell, in: ''[[Analytica Chimica Acta]]'' '''1999''', ''383'', 27–46.</ref><ref>P. A. Jekel, in: ''[[Analytical Biochemistry]]'' '''1983''', ''134'', 347–54.</ref><ref>S. D. Patterson, in: ''[[Electrophoresis]]'' '''1995''', ''16'', 1104–1114.</ref> Glu-C,<ref name="Scheler, C et al, 1998">C. Scheler, in: ''[[Electrophoresis]]'' '''1998''', ''19'', 918–27.</ref><ref>J. Houmard, G. R. Drapeau, in: ''[[Proc. Natl. Acad. Sci. USA]]'' '''1972''', ''69'', 3506–9.</ref><ref>M. A. Farah, in: ''[[Biochimica et Biophysica Acta|Biochim. Biophys. Acta]]'' '''2005''', ''1725'', 269–82.</ref> und Asp-N<ref>L. Wang, in: ''[[Pharmaceutical Research|Pharm. Res.]]'' '''2005''', ''22'', 1338–1349.</ref> Verwendung. Diese Proteasen schneiden spezifisch nur an einer Aminosäure.<ref name="Michalski, WP und Shiell, BJ, 1999" /> Damit erhält man eine begrenzte Anzahl an längeren Peptiden.

Die Analyse der kompletten [[Aminosäuresequenz|Primärsequenz]] eines Proteins mit nur einer Protease ist in der Regel nicht möglich. In diesem Fall kann das Zielprotein in mehreren Ansätzen mit unterschiedlichen Proteasen verdaut werden. Dabei werden partiell überlappende Peptide generiert, die anschließend zur Gesamtsequenz zusammengesetzt werden können.<ref name="Scheler, C et al, 1998" /><ref>G. Choudhary, in: ''[[Journal of Proteome Research|J. Proteome Res.]]'' '''2003''', ''2'', 59–67.</ref><ref>C. Wa, in: ''[[Analytical Biochemistry|Anal. Biochem.]]'' '''2006''', ''349'', 229–41.</ref>

Für den Verdau müssen die im Gel fixierten Proteine für die Protease zugänglich gemacht werden. Um das Eindringen des Enzyms zu erleichtern werden die [[Gel]]stücke zunächst mit Acetonitril [[Dehydratisierung (Chemie)|dehydratisiert]] und nachfolgend in einem proteasehaltigen [[Pufferlösung|Verdaupuffer]] gequollen. Die Methode beruht auf der Annahme, dass beim Quellungsvorgang die Protease mit in das Gel aufgenommen wird.<ref>U. Hellman, in: ''[[Analytical Biochemistry|Anal. Biochem.]]'' '''1995''', ''224'', 451–5.</ref> Das Eindringen der Protease in die Gelmatrix ist jedoch ein weitgehend [[diffusion]]sabhängiger Prozess. Das Trocknen des Gels scheint den Vorgang der Diffusion deshalb nicht zu unterstützen.<ref name="Granvogl, B et al, 2007" /><ref name="Havlis, J et al, 2003" /> Zur Optimierung des In-Gel-Verdaus bietet sich folglich eine maximale Zerkleinerung der Gelmatrix an, um die Diffusionsstrecke für die Protease drastisch zu verringern.

Der In-Gel-Verdau findet in der Regel über Nacht statt. Bei Verwendung von Trypsin als Protease und einer Temperatur von 37 °C beträgt die Inkubationszeit etwa 12–15 Stunden. Versuche haben jedoch gezeigt, dass bereits nach drei Stunden genug Material für die [[Massenspektrometrie|massenspektrometrische]] Analyse vorhanden ist.<ref>E. J. Finehout, K. H. Lee, in: ''[[Electrophoresis]]'' '''2003''', ''24'', 3508–3516.</ref> Die Optimierung der Bedingungen für die Protease ([[PH-Wert|pH]], Temperatur) erlaubt den vollständigen Verdau einer Probe aber auch in 30 Minuten.<ref name="Havlis, J et al, 2003" />

=== Extraktion ===
Nach Beendigung des Verdauprozesses müssen die entstandenen [[Peptid]]e aus der [[Analysenprobe|Gelmatrix]] [[Extraktion (Verfahrenstechnik)|extrahiert]] werden. Dies geschieht meist in zwei Extraktionsschritten. Hierbei werden die [[Gel]]partikel in einer Extraktionslösung inkubiert und die aus den Gelpartikeln herausgelösten Peptide mit dem Überstand abgehoben. Die Hauptmenge an Peptid wird bereits mit einem Extraktionsschritt erhalten. Zusätzliche Extraktionen verbessern die Peptid-Ausbeute zusammengenommen nur etwa um fünf bis zehn Prozent.<ref name="Speicher, KD et al, 2000" /> Um die Extraktion von Peptiden mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften zu gewährleisten, werden serielle Extraktionen in basischen bzw. sauren Lösungen durchgeführt. Für die Extraktion der [[PH-Wert|sauren]] Peptide findet eine in [[Konzentration (Chemie)|Konzentration]] und Zusammensetzung zum Verdaupuffer analoge Lösung Verwendung; die basischen Peptide werden in Abhängigkeit von der Art der MS-Analyse entweder mit [[Ameisensäure]] ([[Elektrospray-Ionisation|ESI]]) oder mit [[Trifluoressigsäure]] ([[MALDI]]) in niedriger Konzentration extrahiert. Anhand von Modell[[protein]]en wurde belegt, dass etwa 70–80 % der zu erwartenden Peptidmenge aus dem Gel extrahiert werden.<ref name="Speicher, KD et al, 2000" /> Viele Protokolle enthalten zur Extraktion zusätzlich einen Anteil an [[Acetonitril]], das ab einer Konzentration von 30 % (v/v), die [[Adsorption]] von Peptiden an die Oberflächen von [[Reaktionsgefäß]]en und [[Pipette]]nspitzen vermindert.<ref>H. Erdjument-Bromage, in: ''[[J. Chromatogr. A]]'' '''1998''', ''826'', 167–81.</ref> Die vereinigten Extrakte werden anschließend in einer [[Vakuumzentrifuge]] bis zur Trockene eingedampft. Wurde das volatile [[Ammoniumhydrogencarbonat]] als Puffersalz zur basischen Extraktion verwendet, so wird dieses während des Trocknungsprozesses zum Teil entfernt. In der getrockneten Form können die isolierten Peptide bei −20 °C mindestens sechs Monate gelagert werden.

== Probleme ==
Entscheidende Nachteile der Methoden zum In-Gel-Verdau sind aufgrund der multiplen Bearbeitungsschritte die Anfälligkeit für [[Stoffreinheit#Verunreinigung (Kontamination)|Kontaminationen]] (v. a. [[Keratin]]) und der hohe Zeitbedarf. Diese Nachteile konnten durch die Entwicklung optimierter Protokolle und spezialisierter Reaktionsgefäße gemindert werden.<ref name="Granvogl, B et al, 2007" />

Schwerwiegender sind die Verluste an Probenmaterial während der Präparation, die bei der häufig an der Nachweisgrenze operierenden massenspektrometrischen Proteinanalyse über den Erfolg der Methode entscheiden können. Diese treten beispielsweise auf durch Auswaschung während der einzelnen Bearbeitungsschritte, [[Adsorption]] an Oberflächen von Reaktionsgefäßen oder [[Pipette]]nspitzen, unvollständige Extraktion der Peptide aus dem Gel und/oder durch schlechte [[Ionisierung]] einzelner Peptide.<ref name="Speicher, KD et al, 2000" /><ref>I. I. Stewart, in: ''[[Rapid Communications in Mass Spectrometry|Rapid Commun. Mass Spectrom.]]'' '''2001''', ''15'', 2456–2465.</ref> In Abhängigkeit von den physikalisch-chemischen Eigenschaften der Peptide können die Verluste zwischen 15 und 50 % variieren. Diese Probleme konnten aufgrund der Heterogenität der unterschiedlichen Peptide in Bezug auf diese Eigenschaften bisher nicht allgemeingültig gelöst werden.

== Anwendungen ==
Bei den kommerziellen Umsetzungen des In-Gel-Verdaus kann man zwischen Lösungen für Niedrig- und Hochdurchsatz unterscheiden.

=== Hochdurchsatz ===
Aufgrund des hohen Zeit- und Arbeitsaufwandes für das Standardverfahren war der manuelle In-Gel-Verdau auf eine relativ kleine Anzahl von Proben limitiert, die eine Person in gegebener Zeit abarbeiten konnte. Mit dem Bedarf, groß angelegte Versuchsserien in der [[Proteomik]] durchzuführen, und den Möglichkeiten, die moderne massenspektrometrische Methoden und die Leistungsfähigkeit der Computertechnik in Bezug auf die automatische Messung und Auswertung bieten, wurde die Entwicklung einer automatisierten Probenvorbereitung angestoßen.<ref>T. Houthaeve, in: ''[[Journal of Protein Chemistry|J. Prot. Chem.]]'' '''1997''', ''16'', 343–348.</ref> Heute werden in Laboren, die routinemäßig eine große Anzahl an Proben verarbeiten müssen, standardmäßig automatisierte Lösungen angewendet. Der Grad der [[Automatisierung]] reicht dabei von einfachen Pipettier[[roboter]]n bis zu hochentwickelten Proteomics-Workstations, die alle Schritte vom Gel bis zum Massenspektrometer automatisch durchführen. Diese Systeme bestehen normalerweise aus einem Spot-Picker, einem Verdau-Roboter und einem Spotter.

Der Spot-Picker wird mit einer Pick-Liste programmiert, die in einem 2D-Gel-Analyseprogramm erzeugt wird. Nach dieser Liste sticht das Gerät aus einem 2D-Gel die gewünschten Protein-Spots aus und überführt sie auf eine [[Mikrotiterplatte]]. Dort führt der Verdau-Roboter die notwendigen Schritte für den In-Gel-Verdau durch. Der Spotter erzeugt schließlich mit der Peptidlösung die Spots auf dem MALDI-Target bzw. beschickt eine geeignete Mikrotiterplatte zur automatischen ESI-MS-Messung.
Hersteller von automatisierten In-Gel-Verdau-Systemen sind Intavis (DigestPro), [[GE Healthcare]] (Ettan Series), [[Bruker|Bruker Daltonics]] (PROTEINEER), [[PerkinElmer|Perkin Elmer]] (MultiPROBE® II) und [[Shimadzu]] (Xcise).
Neben der großen Anzahl von gleichzeitig zu bearbeitenden Proben liegt der Vorteil der Automation in dem geringeren Personalbedarf und der verbesserten Standardisierung des Verfahrens. Beim manuellen In-Gel-Verdau können die Ergebnisse aufgrund der vielen durchzuführenden Schritte von der Erfahrung des Anwenders abhängig sein und es gibt eine große Kontaminationsgefahr. Die verbesserte Ergebnisqualität wird deshalb als ein Hauptvorteil der vollautomatisierten Abarbeitung der Proben genannt.<ref>L. Canelle, in: ''[[Rapid Communications in Mass Spectrometry|Rapid Commun. Mass Spectrom.]]'' '''2004''', ''18'', 2785–2794.</ref>

Nachteile der automatisierten Lösungen sind die Kosten für Roboter, Wartung und das oft proprietäre Verbrauchsmaterial genauso wie das komplizierte Bedienen der Systeme. So ist das automatische Ausstechen auf [[Digitalsignal|digitalisierte]] Informationen der Spot-Position angewiesen, was die Nutzung von Gel-Analyse-Programmen und speziellen [[Scanner (Datenerfassung)|Scannern]] notwendig macht. Diese langwierige Prozedur und die (wirtschaftliche) Notwendigkeit, das System nur mit einer gewissen Anzahl von Proben laufen zu lassen (die kleinste hierfür übliche Mikrotiterplatte fasst 96 Proben) verhindert das spontane Auswählen und Analysieren einer kleinen Anzahl von Spots aus einem einzelnen Gel. Des Weiteren ist die Menge der generierten Daten aus der nachfolgenden ebenfalls automatisierten MS-Analyse sehr kritisch zu betrachten, da deren Qualität oft fraglich ist und daher der sorgfältigen Evaluierung bedarf, was wesentlich länger braucht als diese Daten zu erheben.<ref>D. A. Stead, in: ''[[Briefings in Bioinformatics|Brief. Bioinform.]]'' '''2008'''</ref><ref name="Hu, J et al, 2005">Hu, J et al, ''[[Briefings in Functional Genomics|Brief. Funct. Genomics Proteomics]]'' '''2005''', ''3'', 322–31.</ref>

=== Niedrigdurchsatz ===
Die erwähnten Nachteile begrenzen den vernünftigen Einsatz von automatisierten In-Gel-Verdau-Systemen auf Routine-Laboratorien während Forschungs-Labore aufgrund ihres Bedarfs an einer flexibleren Nutzung der Instrumente zur [[Proteinidentifikation]] häufig bei den manuellen Methoden bleiben. Für diese Anwendergruppe hat die Industrie Kit-Systeme für den In-Gel-Verdau entwickelt.

Die meisten dieser Kit-System sind bloße Sammlungen von Chemikalien und Enzymen, die für den In-Gel-Verdau benötigt werden, wobei die Durchführung der Methode an sich nicht verändert wurde. Der Vorteil für den unerfahrenen Kunden liegt darin, das die Chemikalien und Enzyme sowie das Protokoll von einem Hersteller bezogen werden, womit das Funktionieren der Methode garantiert wird. Hersteller dieser Kit-Systeme sind [[Sigma-Aldrich]] (Trypsin Profile IGD Kit), Pierce (In-Gel Tryptic Digestion Kit) und [[Agilent]] (Protein In-gel Tryptic Digestion Kit).

Nur wenige Firmen haben versucht das Handling des In-Gel-Verdaus zu verbessern, um auch ohne Roboter einen einfacheren und standardisierten Arbeitsablauf zu erreichen. Das MontageTM In-Gel Digest Kit von [[Merck Millipore|Millipore]] basiert auf dem Standard-Protokoll für den In-Gel-Verdau, verlegt jedoch die Prozess-Schritte in eine spezielle Mikrotiterplatte, wodurch eine größere Anzahl an Proben simultan verarbeitet werden können. Die Lösungen für die verschiedenen Schritte werden hinzu pipettiert, wogegen das Absaugen nach unten durch den Boden der Platte unter Verwendung von Vakuum erfolgt. Hierdurch wird die Anzahl der Pipettierschritte für den Anwender reduziert, da zum einen das manuelle Entfernen der Flüssigkeiten entfällt und zum anderen das Zuführen unter Verwendung von Mehrkanal-Pipetten oder sogar Pipettier-Robotern erfolgen kann. Einige Hersteller haben dieses System sogar für die Verwendung mit ihren automatisierten Hochdurchsatz-Systemen adaptiert. Diese Details des Verfahrens verdeutlichen die Ausrichtung des Millipore-Systems auf Laboratorien, die zumindest einen mittleren Probendurchsatz haben.

Einen vollständig anderen Ansatz hat die deutsche Firma OMX GmbH verfolgt. Die Produktreihe OMX-S® ist auf die gleichzeitige Bearbeitung von bis zu 24 Proben ausgerichtet, wobei sowohl ein speziell modifiziertes Protokoll als auch neu entwickelte Reaktionsgefäße verwendet werden. Das System ist aus einer kritischen Analyse des konventionellen Protokolls für den In-Gel-Verdau entstanden, wo etwa 30 Schritte und 16 Stunden für den Gesamtprozess vom Gel zur Peptid-Lösung veranschlagt werden.<ref name="Jeno, P et al, 1995" /><ref name="Shevchenko, A et al, 1996" /><ref name="Borchers, C et al, 2000" /><ref name="Shevchenko, A et al, 2006" /> Das Ergebnis der Untersuchung war ein auf vier Schritte und etwa zwei Stunden verkürztes Protokoll.<ref name="Granvogl, B et al, 2007" /> Prozess-Schritte, die nicht zu einer signifikanten Verbesserung der letztendlichen Peptid-Ausbeute führen, wurden darin weggelassen und die notwendige Inkubationszeit für den Verdau durch Erhöhung der Temperatur verringert. Die in dem System verwendeten, speziellen Reaktionsgefäße ermöglichen die Durchführung aller Schritte des In-Gel-Verdaus, vom Ausstechen bis zur Peptid-Extraktion, in einem Gefäß. Der Gel-Spot wird bei diesem Verfahren mit dem integrierten Stechwerkzeug ausgestochen und in den Reaktionsraum zentrifugiert, wobei es eine kleine Öffnung passieren muss und dadurch in kleine Stücke zerrissen wird. In diesem Reaktionsraum verbleibt das Gel für den gesamten Prozess, es werden lediglich die Lösungen durch den Stechkanal hinzugegeben und durch Zentrifugation wieder entfernt.<ref>{{Internetquelle |url=http://www.omx-online.com/manual_omxs.pdf |titel=OMX-S® basic Instruction Manual April/08 |format=(PDF; 221 kB) |sprache=en |offline=ja |archiv-url=https://web.archive.org/web/20100928195938/http://www.omx-online.com/manual_omxs.pdf |archiv-datum=2010-09-28 |abruf=2024-06-23}}</ref> Dieses Verfahren stellt eine deutliche Vereinfachung und Beschleunigung des manuellen In-Gel-Verdaus dar, da aber jede Probe einzeln bearbeitet werden muss, ist die Bearbeitung größerer Ansätze hiermit immer noch sehr arbeitsintensiv und in dieser Hinsicht nicht mit den automatisierten Systemen zu vergleichen.

== Einzelnachweise ==
<references />

[[Kategorie:Protein-Methode]]

In-Gel-Verdau - Versionsgeschichte

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