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Bei '''iTRAQ''' ('''''i'''sobaric '''T'''ags for '''R'''elative and '''A'''bsolute '''Q'''uantitation'') handelt es sich um eine experimentelle Methode aus dem Bereich der [[Proteinanalytik]] und [[Proteomik]]. Sie dient dazu, verschiedene [[Protein]]e und [[Peptid]]e per [[Massenspektrometrie]] gemeinsam zu [[Quantifizierung|quantifizieren]].<ref name="pmid15385600">{{cite journal |author=PL. Ross, YN. Huang, JN. Marchese, B. Williamson, K. Parker, S. Hattan, N. Khainovski, S. Pillai, S. Dey, S. Daniels, S. Purkayastha, P. Juhasz, S. Martin, M. Bartlet-Jones, F. He, A. Jacobson, DJ. Pappin |date=2004 |title=Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents |journal=Mol. Cell. Proteomics |volume=3 |issue=12 |pages=1154–1169 |doi=10.1074/mcp.M400129-MCP200 |pmid=15385600 |language=en}}</ref><ref name="pmid16574745">{{cite journal |author=LR Zieske |date=2006 |title=A perspective on the use of iTRAQ reagent technology for protein complex and profiling studies |journal=J. Exp. Bot. |volume=57 |issue=7 |pages=1501–1508 |doi=10.1093/jxb/erj168 |pmid=16574745 |language=en}}</ref><ref name="pmid17162667">{{cite journal |author=PR Gafken, PD Lampe |date=2006 |title=Methodologies for characterizing phosphoproteins by mass spectrometry |journal=Cell Commun. Adhes. |volume=13 |issue=5–6 |pages=249–262 |doi=10.1080/15419060601077917 |pmid=17162667 |pmc=2185548 |language=en}}</ref> iTRAQ verwendet unter anderem die [[Isobarenmarkierung]] und die [[Tandem-Massenspektrometrie]].

== Verfahren ==
[[Datei:ITRAQ 8plex kit.JPG|mini|hochkant|iTRAQ–Kit für 8 Proben]]
iTRAQ wird in der [[Proteomik]] zur [[Proteincharakterisierung]] verwendet, da mit der Methode bis zu vier, mit der Weiterentwicklung ''8-Plex'' bis zu acht Proben gleichzeitig untersucht werden können.<ref name="pmid17880003">{{cite journal |author=L. Choe, M. D’Ascenzo, NR. Relkin, D. Pappin, P. Ross, B. Williamson, S. Guertin, P. Pribil, KH Lee |date=2007 |title=8-plex quantitation of changes in cerebrospinal fluid protein expression in subjects undergoing intravenous immunoglobulin treatment for Alzheimer’s disease |journal=Proteomics |volume=7 |issue=20 |pages=3651–3560 |doi=10.1002/pmic.200700316 |pmid=17880003 |language=en}}</ref> Zur Anwendung des iTRAQ-Verfahrens ist es zunächst notwendig, den [[N-Terminus]] und die [[Amine|Amino]]-[[Seitenkette]]n der in den Proben vorhandenen [[Peptid]]e mit [[Kovalente Bindung|kovalent]] gebundenen mit verschiedenen Molekülen (genannt ''Label'' bzw. ''Tag'') verschiedener [[Molmasse]]n zu markieren. Dazu kommen derzeit zwei verschiedene Reagenzien zum Einsatz: ''4-plex'' und ''8-plex''. Die Tags besitzen unterschiedliche Massen, fragmentieren im [[Massenspektrometer]] verschieden und können daher im [[Massenspektrum]] unterschieden werden.

Es können beliebige Peptide verschiedenster Herkunft markiert werden. Die gemeinsam zu untersuchenden Proben werden anschließend vereint (''gepoolt''), dann üblicherweise per nano-[[Hochleistungsflüssigkeitschromatographie|HPLC]] [[Fraktion (Chemie)|fraktioniert]] und mittels Tandem-[[Massenspektrometrie]] ([[Massenspektrometrie#MS/MS (auch Tandem-Massenspektrometrie)|MS/MS]]) analysiert. Eine nachfolgende Datenbanksuche mit den erhaltenen Fragmentierungsdaten erlaubt es, die Peptide zu identifizieren und so die entsprechenden Proteine zu bestimmen.

Die Fragmentierung der eingeführten Tags erzeugt dabei im unteren Massenbereich in Abhängigkeit vom verwendeten Tag-Typ jeweils ein Ion mit einer typischen Masse, das sogenannte ''Reporter-Ion'', dessen Häufigkeit des Auftretens dazu verwendet werden kann, die Menge der im gleichen [[Massenspektrum|Spektrum]] vorhandenen Peptide (und damit die Proteine) relativ zueinander zu bestimmen. Es handelt sich also um eine gel-freie Methode zur relativen Quantifizierung (vergleichsweise Mengenbestimmung).

Ist die absolute Menge einer der Proben bekannt, erlaubt das Verfahren auch eine absolute Quantifizierung, da sich die Menge jeder weiteren Probe über das Verhältnis berechnen lässt.

== Datenauswertung ==
=== Peptid-Ebene ===
[[Datei:MassenSpektrum-iTRAQ.png|mini|Beispiel für iTRAQ-Reporter im Massenspektrum, Reporter links rot eingekreist. Die einfach geladenen Reporter-Ionen werden im unteren Spektrum sichtbar bei den Masse/Ladungs-Verhältnissen (m/z) 114, 115, 116 und 117.]]

Die Signale der Reporter-Ionen in jedem MS/MS-Spektrum erlauben es, die relative Häufigkeit (''Ratio'') der Peptide zum Reporter zu berechnen, die über dieses Spektrum identifiziert wurden. Aufgrund von Messungenauigkeiten kann es durchaus auftreten, dass die Reporter-Ionen durch jeweils mehr als ein Signal im Spektrum vertreten sind und diese auf geeignete Weise und ohne Informationsverfälschung zu einem Peak zusammengefasst werden müssen. Um beispielsweise die Intensität mehrerer Peaks zusammenzufassen, gibt es zwei mögliche Vorgehensweisen:
* [[Addition|Summieren]] der Intensitäten der Peaks
* [[Integralrechnung|Integration]]
Hier die Fläche des Spektrums zu integrieren führt zu größeren Fehlern, ''falls'' die Abstände der Peaks und die Anzahl der Peaks nicht gleich sind.<ref name="BMC_2007">A. M. Boehm, S. Puetz, D. Altenhofer, A. Sickmann, M. Falk: ''Precise protein quantification based on peptide quantification using iTRAQ''. In: ''BMC Bioinformatics'', 2007, 8: S. 214; [[doi:10.1186/1471-2105-8-214]].</ref> Die Intensitäten dieser Signale sollten also addiert werden, um in diesem Fall einen kleineren Fehler zu erhalten.

=== Protein-Ebene ===
Die Ratios der Peptide sind [[Logarithmische Normalverteilung|log-normalverteilt]].<ref name="BMC_2007" /> Daher repräsentiert der [[Median]] der Peptid-Ratios eines Proteins die relative Quantifizierung dieses Proteins im Vergleich zum Reporter mit bekannter Menge.<ref name="BMC_2007" />

=== Software ===
Die Daten der MS/MS-Spektren können mit folgender frei verfügbarer Software analysiert werden
* ''i-Tracker'', ein einfaches Programm, das um die Peaks eine Trapezfläche konstanter Breite berechnet und diese zur Bestimmung der Ratios verwendet.<ref name="i-Tracker">{{cite journal |author=IP. Shadforth, PJ. Dunnley, KS. Lilley, C. Bessant |date=2005 |title=i-Tracker: For quantitative proteomics using iTRAQ |journal=BMC Genomics |volume=6 |pages=145 |doi=10.1186/1471-2164-6-145 |pmid=16242023 |pmc=1276793 |language=en}}</ref>
* ''Quant'',<ref group="A">[https://sourceforge.net/projects/protms/files/Quant/Quant%20(Mathlab)%201.00/ Download auf sourceforge.net]</ref> ein Matlab-Skript, das den statistisch präzisen Algorithmus implementiert.<ref name="BMC_2007" />
* ''Quant for windows'',<ref group="A">[https://sourceforge.net/projects/protms/files/Quant/ Download auf sourceforge.net]</ref> die Windows-Implementierung von Quant.<ref>A. M. Boehm, D. Altenhöfer, S. Pütz: ''Precise and Statistically Sound Protein Quantification in Mass Spectrometry Based Proteomics Using iTRAQ''. In: J. Küng, K. Schneider, R. Wagner, 2nd International Conference on Bioinformatics Research and Development (BIRD’08), Schriftenreihe Informatik, 26. Trauner Verlag, Linz 2008, S. 3–12.</ref>
* ''jTraqX'',<ref group="A">[https://sourceforge.net/projects/protms/files/jTraqX/ Download auf sourceforge.net]</ref> die portable Java-Implementierung von Quant.<ref>T. Muth, D.Keller, S. M. Puetz, L. Martens, A. Sickmann, A. M. Boehm: ''jTraqX: a Free, Platform Independent Tool for Isobaric Tag Quantitation at the Protein Level''. In: ''Proteomics'', 2010, 10(6), S. 1223–1225; [[doi:10.1002/pmic.200900374]].</ref>

== Anmerkungen ==
<references group="A" />

== Einzelnachweise ==
<references />

[[Kategorie:Massenspektrometrie]]
[[Kategorie:Protein-Methode]]
[[Kategorie:Abkürzung]]
[[Kategorie:Biochemisches Nachweisverfahren]]

ITRAQ - Versionsgeschichte

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