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[[Datei:Screening robotics for HTS-1-.jpg|mini|High-Throughput-Screening-Roboter]]
[[Datei:Protein pattern analyzer.jpg|mini|Pipettierautomat Tecan Genesis bei der Probenvorbereitung]]

'''High-Throughput-Screening''' (HTS), auch '''Hochdurchsatz-Screening''' genannt, ist eine vor allem in der [[Pharmaforschung]] angewandte automatisierte Methode, bei der im Hochdurchsatz an Zehntausenden bis Millionen von Substanzen [[Biochemie|biochemische]], [[Genetik|genetische]] oder [[Pharmakologie|pharmakologische]] Tests durchgeführt werden. Werden mehr als 100.000 Stoffe pro Tag untersucht, spricht man auch vom ''Ultra''-High-Throughput-Screening (uHTS).<ref name="pmid18694386">{{cite journal |author=Wunder F, Kalthof B, Müller T, Hüser J |title=Functional cell-based assays in microliter volumes for ultra-high throughput screening |journal=[[Comb Chem High Throughput Screen]]. |volume=11 |issue=7 |pages=495–504 |year=2008 |month=August |pmid=18694386 |doi= |url= |language=en}}</ref> Mittels des High-Throughput-Screening wird insbesondere nach neuen biologisch aktiven Substanzen gesucht, aus denen [[Leitstruktur (Pharmakologie)|Leitstruktur]]en abgeleitet werden, um neue [[Arzneistoff]]e zu entwickeln.

== Durchführung ==
Beim High-Throughput-Screening werden umfangreiche [[Molekülbibliothek]]en durchsucht, wobei die Suche hohe Anforderungen an die Automatisierung, die Testverfahren und die Auswertung stellt.

=== Testverfahren ===
Beim High-Throughput-Screening zur Entdeckung neuer [[Pharmakologie|pharmakologisch]] aktiver Substanzen finden Target- oder Phänotyp-basierte Testverfahren (Assays) Anwendung. Entscheidend für ein korrektes Ergebnis ist, dass das Erfolgskriterium im Labor mit den Vorgängen in der Natur korreliert und das Testverfahren und die Zielvorgaben geeignet sind, das gewünschte Ergebnis zu erreichen. Eine zentrale Regel lautet: „''you get what you screen for''“.<ref>[[Frances H. Arnold]]: {{Webarchiv |url=http://www.che.caltech.edu/groups/fha/publications/Arnold_ACR_1998.pdf |text=''Design by directed evolution.'' |wayback=20190728055721 |archiv-bot=}} Acc. Chem. Res. (1998), Band 31, S. 125–131.</ref>

==== Target-basiert ====
[[Datei:Microplates.jpg|mini|Mikrotiterplatten mit 96, 384 und 1536 Wells]]
Bei Target-basierten Screenings wird die Interaktion der Testsubstanzen mit bestimmten definierten Zielstrukturen (Targets) untersucht. Targets können zum Beispiel [[Protein]]e sein, die mit einer [[Krankheit]] oder einem physiologischen Prozess in Verbindung stehen. Target-basierte Screenings repräsentieren in der pharmazeutischen Industrie die häufigste Form des Screenings von niedermolekularen Substanzen, um deren biologische Aktivität zu bestimmen. Sie werden in der Regel in [[Mikrotiterplatte]]n mit gereinigten oder ungereinigten Proteinen oder indirekt mit [[Zelle (Biologie)|Zellen]], die das Target-Protein bilden, durchgeführt. Die Interaktion einer Testsubstanz mit dem Target kann direkt in Bindungsassays (in der Regel über die Verdrängung eines markierten Referenzliganden vom Target) oder indirekt über die Beeinflussung der vom Targetprotein aktivierten Signalwege (z. B. Aktivierung von [[Second Messenger]]n, [[Protein-Protein-Interaktion]]en, Protein-[[Phosphorylierung]]en und [[Genaktivierung]]en) und enzymatischen Reaktionen bestimmt werden. Dazu werden insbesondere biochemische Methoden eingesetzt, bei denen ein Signal als eine Änderung der Farbintensität, der [[Fluoreszenz]] oder der [[Lumineszenz]] gemessen wird. Aus dem [[Signal-Rausch-Verhältnis]] folgt: Je stärker die Änderung der im Test ausgewerteten Signalintensität, desto besser geeignet sind die Testverfahren. Auf Lumineszenz basierende Verfahren verursachen eine vielfache Signalveränderung und sind daher oft besser geeignet als [[fotometrisch]]en und [[Fluorimetrie|fluorimetrischen]] Methoden. Eigenfarbe oder Eigenfluoreszenz von Testsubstanzen verschlechtern das Signal-Rausch-Verhältnis der fotometrischen und fluorimetrischen Messung. Auch [[Szinimetrie|szintimetrische]] Testmethoden, wie beispielsweise [[Radioligand-Bindungsstudien]], sind hochsensitiv. Das Anfallen radioaktiver Abfälle ist jedoch ein zentrales Problem bei der Durchführung von szintimetrischen Testungen. Weitere Eigenschaften der Testsubstanzen, wie beispielsweise [[Löslichkeit]] und [[Chemische Stabilität|Stabilität]], spielen eine entscheidende Rolle und müssen bei der Versuchsplanung berücksichtigt werden.

==== Phänotyp-basiert ====
Beim Phänotyp-basierten Screening werden die Effekte von Testsubstanzen auf lebende Zellen oder Gewebe untersucht, also die Auswirkungen der Applikation der Testsubstanz auf den Phänotyp der Zelle oder des Gewebes. Der Effekt einer Testsubstanz wird anhand einer [[phänotyp]]ischen Änderung, z. B. der Änderung der Zellform, des Zellwachstums oder der Zellfunktion, beurteilt. Hierbei ist es nicht erforderlich, das molekulare Target im Voraus zu kennen, oft dient das Screeningverfahren aber der Identifikation des molekularen Targets. Um das Ergebnis des Screenings nicht zu verfälschen, müssen meist eine Vielzahl an Parametern kontrolliert werden. Mit Phänotyp-basierten Screenings werden insbesondere Molekülbibliotheken durchgemustert, die höhermolekularen Verbindungen enthalten, wie beispielsweise Proteine, [[DNA]] und [[siRNA]]. Neben Zellen und [[Gewebe (Biologie)|Gewebe]] werden auch ganze [[Organismus|Organismen]], wie beispielsweise Fischembryonen, als Modellsysteme eingesetzt. Ein Phänotyp-basiertes Screening wird oft mit Hilfe von automatisierter [[Mikroskopie]] ([[High Content Screening]]) durchgeführt. Oft ist ein High Content Screening gegenüber einem Target-basierten Screening durch den geringeren Durchsatz limitiert.

==== Beurteilung ====
Da die Durchmusterung einer kompletten Molekülbibliothek in einem High-Throughput-Screening oft mehrere Tage bis Wochen dauert, ist ein gleichbleibend zuverlässiges Arbeiten des Testverfahrens eine kritische Voraussetzung. Insbesondere bei Verwendung von Zellen muss mit einer Veränderung mit zunehmender Kultivierungszeit gerechnet werden.

Zur Beurteilung der [[Robustheit]] der Daten eines High-Throughput-Screenings werden Kontrollsubstanzen untersucht. Im einfachsten Fall umfassen diese einerseits Vehikel oder eine bekanntermaßen inaktive Substanz ([[Negativkontrolle]]), und andererseits eine Substanz, die zu einer maximalen Aktivierung oder Inhibition des Tests führt ([[Positivkontrolle]]). Mit Hilfe des Z'-Faktors

:<math>Z' = 1 - \frac{3 \times (\sigma_p + \sigma_n)}{| \mu_p - \mu_n |}</math>,

wobei σp und σn die [[Empirische Standardabweichung|Standardabweichungen]] der Positiv- bzw. Negativkontrolle sowie µp und µn die [[Mittelwert]]e der Positiv- bzw. Negativkontrolle darstellen, lässt sich das Messfenster des High-Throughput-Screenings beurteilen. Assays mit Z'-Faktoren von mindestens 0,5 gelten als optimal. Auch High-Throughput-Screenings bei einem Z'-Faktor von 0 – 0,5 können noch zur Unterscheidung von aktiven und inaktiven Verbindungen geeignet sein.<ref name="isbn3-527-31283-8">{{cite book |author=Hanspeter Gubler |chapter=Methods for statistical analysis, quality assurance and management of primary high-throughput screening data |editor=Gerd Folkers; Jörg Hüser; Raimund Mannhold; Hugo Kubinyi |title=High-Throughput Screening in Drug Discovery (Methods and Principles in Medicinal Chemistry) |publisher=Wiley-VCH |location=Weinheim |year=2006 |pages=151–206 |isbn=3-527-31283-8 |doi= |accessdate= |language=en}}</ref>

=== Automatisierung ===
High-Throughput-Screenings sind aufwändig und werden heute nur noch mit voll- oder zumindest teilautomatisierten [[Laborautomatisierung|Laborautomationssystemen]] durchgeführt. Es werden Roboter oder Automaten für das [[Liquid-Handling]], die Datenaufnahme (Reader, Kameras) und gegebenenfalls die [[Zellkultur]] eingesetzt. Das Testvolumen wird reduziert, und es werden Mikrotiterplatten mit 384, 1536 oder 3456 Näpfchen eingesetzt, um zahlreiche Proben gleichzeitig zu testen und Kosten und Zeit zu sparen.

=== Auswertung ===
Die als Ergebnis des High-Throughput-Screening anfallenden Daten werden statistisch analysiert. Substanzen, die Messwerte jenseits eines bestimmten Schwellenwerts liefern, werden als Treffer („Hits“) eingestuft. Dennoch muss das Auftreten falsch positiver und falsch negativer Ergebnisse berücksichtigt werden. Um die Menge falsch positiver Hits zu reduzieren, wird meist ein zweites, deutlich kleineres Screening durchgeführt, das sich auf die Hits des ersten Screenings beschränkt.

Die aus den Screenings gewonnenen Daten werden auch mit Hilfe von [[Chemoinformatik|chemoinformatischen]] Methoden analysiert. Dazu werden die Hits anhand ihrer molekularen Eigenschaften gefiltert. Auf diese Weise können Substanzen, die beispielsweise auf Grund reaktiver Gruppen (z. B. [[Aldehyd]]e, [[Michael-Akzeptor]]en und [[Nitrogruppe]]n) oder einer Nichterfüllung [[Christopher Lipinski|Lipinskis]] [[Rule of Five]] als ungeeignet für die weitere Entwicklung angesehen werden, von der Kandidatenliste der Leitstrukturen entfernt werden. Schließlich wählt man die vielversprechendsten Hits für die Entwicklung einer Leitstruktur aus.

== Beschränkungen ==
Nur wenige in einem High-Throughput-Screening identifizierte Hits haben die Qualität, als Leitstruktur klassifiziert zu werden. Ein Hit ist somit nicht automatisch eine Leitstruktur und schon gar kein [[Arzneistoff]]. Da High-Throughput-Screenings in der Regel bei einer einzigen Testkonzentration mit Hilfe eines einzigen Assays durchgeführt werden, sind quantitative Aussagen über die Wirkstärke (Potenz) und Selektivität der Testsubstanzen nicht möglich. Viele für die Wirksamkeit und therapeutische Sicherheit einer Substanz notwendige pharmakologische Parameter wie die [[Zellmembran]]- und Gewebepermeabilität sowie die Aufnahme, Verteilung, Metabolisierung, Ausscheidung (ADME) und Toxikologie werden in High-Throughput-Assays nicht oder nur unzureichend berücksichtigt. Die Weiterentwicklung von einem Hit bis hin zu einem Arzneistoff und dessen Zulassung dauert in der Regel etwa 10 bis 12 Jahre.

== Siehe auch ==
* [[High Throughput Experimentation]]

== Einzelnachweise ==
<references/>

== Literatur ==
*{{cite book |author=Gerd Folkers; Jörg Hüser; Raimund Mannhold; Hugo Kubinyi |title=High-Throughput Screening in Drug Discovery (Methods and Principles in Medicinal Chemistry) |publisher=Wiley-VCH |location=Weinheim |year=2006 |pages= |isbn=3-527-31283-8 |doi= |accessdate= |language=en}}

[[Kategorie:Computerchemie]]
[[Kategorie:Pharmakologie]]
[[Kategorie:Photometrie]]
[[Kategorie:Biochemisches Nachweisverfahren]]

Hochdurchsatz-Screening - Versionsgeschichte

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