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2023-04-14T14:30:12Z

Ein paar Kleinigkeiten ergänzt, aber der Titel macht keinen Sinn, der Aufbau für eine Enzyklopädie ungeeignet, Referenzen fehlen, Web-links nicht mehr aktiv, sollte von den Initiatoren auf Stand gebracht werden oder gelöscht.

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Im Rahmen des '''GFP-cDNA'''-Projektes wird die Lokalisation von [[Protein]]en in [[Eukaryoten|eukaryotischen]] [[Zelle (Biologie)|Zellen]] mit Hilfe von [[Fluoreszenzmikroskopie]] dokumentiert. Experimentelle Ergebnisse werden durch bioinformatische Analysen ergänzt und im Internet frei zugänglich in einer [[Datenbank]] veröffentlicht. Mittels einer Suchfunktion kann in dieser Datenbank nach Proteinnamen und Proteinen mit speziellen Eigenschaften oder Motiven gesucht werden.
Das Projekt entsteht in Zusammenarbeit der Forschungsgruppen von Rainer Pepperkok am [[European Molecular Biology Laboratory]] (EMBL) und Stefan Wiemann am [[Deutsches Krebsforschungszentrum|Deutschen Krebsforschungszentrum]] (DKFZ).

== Welche Experimente werden durchgeführt? ==
Die [[cDNA]]-Produkte neu entdeckter [[offener Leserahmen]] ({{enS|open reading frame}}) werden mit GFP ([[Green fluorescent protein|Grün Fluoreszierendes Protein]]) markiert, in eukaryotischen Zellen exprimiert und die Lokalisation mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet.

Dazu sind folgende Schritte nötig:

=== Klonierung im Hochdurchsatz ===
Die [[Klonierung]] sehr vieler ORFs wird durch eine Klonierungstechnik ermöglicht, die auf [[Rekombination (Genetik)|Rekombinationsmechanismen]] von [[Bakteriophagen]] beruht ([[Gateway-Klonierung|Gateway]] von [[Invitrogen]] oder Creator von [[Becton Dickinson|BD Biosciences]]). Dadurch sind keine [[Restriktionsenzym]]e nötig und mögliche [[Restriktionsstelle]]n müssen nicht berücksichtigt werden. Das ORF wird zunächst in einen Empfängervektor, den sogenannten entry clone, eingebracht. Von diesem [[Vektor (Gentechnik)|Vektor]] aus können die ORFs mittels Rekombination in andere [[Plasmid]]e transferiert werden.
Für die Analyse der Proteinlokalisation werden die ORFs in GFP-Fusionsvektoren geklont. Dabei wird jedes ORF jeweils einmal [[C-Terminus|C-terminal]] und [[N-Terminus|N-terminal]] mit GFP fusioniert. Dies ist notwendig, da die GFP-Markierung [[Signalsequenz]]en an den Enden des Proteins maskieren kann.

=== Transfektion in eukaryotische Zellen, Expression ===
Die GFP-Fusionsvektoren werden in [[Vero-Zellen]] [[Transfektion|transfiziert]] und [[Genexpression|exprimiert]]. Besonders interessante ORFs werden auch in PC12-Zellen und [[Neuron]]en des [[Hippocampus]] eingebracht.

=== Proteinlokalisierung ===
Die subzelluläre Lokalisierung des [[Fusionsprotein]]s wird unter dem Fluoreszenz-Mikroskop zu verschiedenen Zeitpunkten beobachtet. Nach der Lokalisierung in den lebenden Zellen können die Zellen [[Fixierung (Präparationsmethode)|fixiert]] und zusätzliche Kolokalisationsexperimente mittels [[Immunfluoreszenz]]färbung durchgeführt werden.
[[Datei:Localisations0dt2.jpg|mini|none|Beispiele subzelluläre Lokalisation]]

=== Bioinformatische Analyse ===
Die [[DNA-Sequenz|Sequenz]] der eingesetzten cDNA ist bekannt und kann für bioinformatische Analysen verwendet werden. Es werden Vorhersagen zur Lokalisation und Funktion des Proteins gemacht und diese mit den experimentellen Ergebnissen verglichen.
Die bioinformatische Analyse wird durch die Bioinformatik-Suchmaschine [[Bioinformatik-Harvester|Harvester]] erleichtert.

=== Zuordnung einer subzellulären Lokalisation ===
Die experimentellen Ergebnisse werden mit der bioinformatischen Analyse verglichen und dem Protein eine subzelluläre Lokalisation zugeordnet (ca. 20 Kategorien). Haben die N-terminale und die C-terminale GFP-Fusion zur selben Lokalisation des Proteins geführt, so hatte die Fusion keinen Einfluss auf die Lokalisation und das Ergebnis wird als bestätigt erachtet. Stimmen die Ergebnisse der beiden Fusionen nicht überein, werden weitere Kriterien wie die bioinformatische Analyse angewandt, um eine Entscheidung treffen zu können. Nicht immer ist eine eindeutige Zuordnung möglich.

[[Datei:Gfp-cdna flowchart dt.jpg|mini|none|Strategie, die zur Zuordnung der subzellulären Lokalisation führt]]

== Welche Daten werden veröffentlicht? ==
Jedes Datenblatt enthält die Fluoreszenzbilder der N-terminalen und der C-terminalen Fusion, die Angabe der zugewiesenen Lokalisation, darüber hinaus beobachtete Lokalisationen, Kommentare und die [[UniProt|Swissprot ID]]. Zu jedem Proteineintrag wird ein Link zur entsprechenden Harvester-Seite bereitgestellt.

== Wie benutze ich die GFP-cDNA-Datenbank? ==
Die Bilder aller lokalisierten Proteine und die entsprechende bioinformatische Analyse können über den „Results Table“ oder den „Results Images“ Link von der Startseite aus aufgerufen werden. Mit dem Suchfenster auf der Startseite kann gezielt nach Proteinen gesucht werden. Spezielle Eigenschaften oder Motive sind ebenfalls als Suchbegriffe möglich.

== Weblinks ==
* [http://gfp-cdna.embl.de/index.html GFP-cDNA Datenbank]
* [http://gfp-cdna.embl.de/html/faqs.html FAQ]

== Quellen ==
* [http://gfp-cdna.embl.de/ Homepage des GFP-cDNA-Projekts]

[[Kategorie:Bioinformatik|Gfp-cDna]]

GFP-cDNA - Versionsgeschichte

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