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2025-08-30T22:57:03Z

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Der '''Edman-Abbau''' ist eine von dem schwedischen Biochemiker [[Pehr Edman]] im Jahr 1949 entwickelte Methode zur [[Proteinsequenzierung]].
Die Sequenzierung erfolgt dabei – im Gegensatz zum [[Schlack-Kumpf-Abbau]] – ausgehend vom ''N''-terminalen Ende des Proteins.

== Geschichte ==
Vor der Entwicklung des Edman-Abbaus wurden Proteine durch [[N-Terminus|''N''-terminale]] Markierung mit [[1-Fluor-2,4-dinitrobenzol]] (nach [[Frederick Sanger]]) versehen, anschließend wurden die Peptidbindungen der Proteine hydrolysiert, wodurch die ''N''-terminale Aminosäure anhand der Markierung bestimmt wurde. Das Dinitrofluorbenzol wurde später gegen [[Dansylchlorid]] ersetzt, welches durch fluoreszente Derivate eine höhere [[Empfindlichkeit (Analytik)|Empfindlichkeit]] der Methode ermöglichte. Eine Bestimmung der Aminosäuresequenz konnte nur ungenau durch einen Zeitverlauf der Aminosäurefreisetzung nach Zugabe einer [[Exopeptidase]] zu einem Protein erreicht werden. Bei dem Edman-Abbau bleibt im Gegensatz zu den vorigen Methoden nach einer Abspaltung des Derivats der Rest des Proteins erhalten und kann in folgenden Zyklen zur Bestimmung der darauf folgenden Aminosäuren eingesetzt werden.

Heutzutage wird der Edman-Abbau nicht mehr häufig verwendet. Um die Aminosäuresequenz eines Proteins zu bestimmen, wird meist entweder die Gensequenz der DNA aus einer [[DNA-Sequenzierung]] oder aus einer Datenbank sequenzierter [[Genom]]e wie [[BLAST-Algorithmus|tBLAST]] ''[[in silico]]'' in eine Proteinsequenz übersetzt. Durch [[Molekulares Display|molekulare Displays]] kann die Gensequenz eines Proteins erhalten werden. Um ein Protein direkt zu identifizieren (''Ansequenzierung''), können identifizierbare Teile eines Proteins neben dem Edman-Abbau auch per [[Massenspektrometrie]] untersucht werden. Die gemessene Masse eines Peptidfragments wird mit allen Peptid-Massen verglichen, die aus dem Genom berechnet werden können oder in einer Datenbank wie [[Mascot (Software)|Mascot]] vorkommen. Zusammen mit einer gleichzeitigen Massenbestimmung aller Proteine mithilfe von [[MALDI-TOF]] kann so das gesamte [[Proteom]] zu einem bestimmten Zeitpunkt bestimmt werden.

== Prinzip ==
Der Edman-Abbau erlaubt die Bestimmung der Reihenfolge von [[Aminosäuren]] (die Aminosäuresequenz) in einem Peptid durch wiederholte Endgruppenbestimmung.<ref>{{Literatur |Autor=P. Edman |Titel=A method for the determination of amino acid sequence in peptides |Sammelwerk=Arch. Biochem. |Band=22 |Nummer=2 |Datum=1949 |Seiten=475 |PMID=18134557}}</ref> Die Peptidkette wird dabei schrittweise abgebaut. Diese Reaktion wird zur Identifikation der [[N-Terminus|''N''-terminalen]] Aminosäure eines Peptids genutzt und besteht aus der Umsetzung eines Peptids mit [[Phenylisothiocyanat]], das auch als [[Edman-Reagenz]] bekannt ist.

[[Datei:Edman Übersicht Version 5.svg|mini|hochkant=3.6|zentriert|Beim Edman-Abbau wird die ''N''-terminale Aminosäure des Proteins (links) unter Einwirkung von Phenylisothiocyanat abgespalten unter Bildung des um eine Aminosäure verkürzten Proteins und eines Phenylthiohydantoin-Derivats (PTH-Derivat). R = [[Alkylrest]] oder [[Wasserstoff]], Ar = [[Phenylrest]], geschlängelte Linie = beliebig lange Fortsetzung der Proteinkette.]]

Da jede Aminosäure einen unterschiedlichen Rest ''R'' besitzt, bildet jede ein unterschiedliches Phenylthiohydantoin-Derivat (PTH-Derivat). Die Identifikation der als PTH-Derivat abgespaltenen ''N''-terminalen Aminosäure erfolgt [[Hochleistungsflüssigkeitschromatographie|chromatographisch]] durch Vergleich mit einem Standard. Man kann nacheinander weitere Abbaue an ein und demselben Protein (jeweils vorher verkürzt um eine Aminosäure am ''N''-terminalen Ende) durchführen und so die Aminosäuresequenz nach und nach bestimmen. Ein ''Sequenator'' ist ein automatisiertes Gerät, das die unbeaufsichtigte Durchführung von bis zu 50 Abbaucyclen erlaubt.<ref name="Bruice">Paula Yurkanis Bruice: ''Organic Chemistry''. 5. Auflage. Pearson Education, 2007, ISBN 978-3-8273-7190-4, S. 1200–1201.</ref> Da die Reaktion mit einer relativen [[Ausbeute (Chemie)|Ausbeute]] von > 98 % verläuft, nehmen einerseits die verschleppten Derivate aus vorhergehenden Zyklen und andererseits die unerwünschten Abspaltungsprodukte von Proteinen, die einen oder mehrere Abspaltungszyklus ausgesetzt haben, mit jedem Zyklus zu, so dass nach maximal 50 Zyklen das [[Signal-Rausch-Verhältnis]] unleserlich wird. Ein Zyklus dauert, je nach Variante, ein bis drei Stunden.

== Mechanismus ==
Im hier dargestellten, von Zerong Wang<ref name="Wang_954-955">Z. Wang (Hrsg.): ''Comprehensive Organic Name Reactions and Reagents.'' 3 Volume Set. John Wiley & Sons, Hoboken, NJ, 2009, ISBN 978-0-471-70450-8, S. 954–955.</ref> vorgeschlagenen Mechanismus bezeichnet R einen Alkylrest oder Wasserstoff, Ar bezeichnet einen [[Arylgruppe|Arylrest]] (meist einen [[Phenylgruppe|Phenylrest]]) und die geschlängelte Linie steht für eine beliebig lange Fortsetzung der Proteinkette:

[[Datei:Edman Mecha Version 3.svg|700px|zentriert|Edmann-Abbau (Mechanismus)]]

Zunächst versetzt man das zu analysierende Protein '''1''' mit einem Phenylisothiocyanatderivat. Dadurch erhält man über eine Zwischenstufe das Thioamid '''2'''. Über eine „Biegung“ kommt es nun zu einem [[Molekular#Intramolekular|intramolekularen]], [[nucleophil]]en Angriff, welcher eine [[Cyclisierung]] zum Anilinothiazolinon (ATZ-Derivat) zur Folge hat. Dadurch bildet sich das Zwitterion '''3''' aus welcher dann über einen Protonentransfer die heterocyclische Verbindung '''4''' entsteht. Dieses trägt noch die verbleibende Proteinkette, welche jedoch im folgenden Schritt abgespalten wird. Man erhält als Produkt das verbleibende Protein '''5''' und das [[Hydantoin]]derivat '''6'''.

Dieser Abspaltungszyklus lässt sich nun mit dem Restpeptid mehrfach wiederholen. Mittels [[Chromatographie]] lassen sich nun das Hydantoinderivat '''6''' und somit die AS-Sequenz bestimmen.<ref name="Reid">{{Literatur |Autor=Gavin E. Reid, Shane E. Tichy, James Pérez, Richard A. J. O’Hair, Richard J. Simpson |Titel=N-Terminal Derivatization and Fragmentation of Neutral Peptides via Ion—Molecule Reactions with Acylium Ions: Toward Gas-Phase Edman Degradation? |Sammelwerk=[[J. Am. Chem. Soc.]] |Band= |Nummer=123 |Datum=2001 |Seiten=1184–1192 |DOI=10.1021/ja003070e}}</ref>
Allerdings sind nur maximal 50 Zyklen<ref name="Wang_954-955" /> möglich. Rückstände – z. B. Reste des Hydantoinderivates aus vorherigen Schritten – können die [[Lösung (Chemie)|Lösung]] so verunreinigen, dass nicht mehr nachvollziehbar ist, welche von ihnen aus dem aktuellen Zyklus abgespalten wurden oder welche von ihnen aus vorherigen Zyklen stammen. Dadurch ist eine Sequenzbestimmung nicht mehr ''sauber'' durchzuführen. Diesen Nachteil kann man umgehen, indem man die Peptid-Kette durch [[Proteolyse]] oder [[Bromcyan]]spaltung in mehrere sich überschneidende Teilketten zerlegt, bevor man mit der Sequenzierung beginnt.<ref name="Wang_954-955" /> Eine Spaltung ist auch bei Proteinen notwendig, deren ''N''-Terminus modifiziert ist, z. B. ''N''-terminal acetylierte Proteine oder Proteine mit ''N''-terminaler [[Pyroglutaminsäure]]. Weitere Nachteile des Edman-Abbaus sind die hohen Kosten, die niedrige Sensitivität von etwa einem Picomol sowie eine Zykluszeit von etwa drei Stunden (mit der Zyklisierung als [[Geschwindigkeitsbestimmender Schritt|geschwindigkeitsbestimmenden Schritt]]).<ref name="Reid" />

== Modifikationen ==
Um die Nachteile eines Verlustes an Probenmaterial während der Extraktionen des Edman-Abbaus zu umgehen (engl. ''{{lang|en|wash-out}}'' ‚Herauswaschen‘), wurde er so modifiziert, dass man ihn in fester Phase ablaufen lassen kann. Man spricht auch von „{{lang|en|solid-phase support synthesis}}“ oder kurz SPSS. Auf diese Weise werden kurze Proteine oder Peptide automatisch sequenziert.<ref>{{Literatur |Autor=Richard A. Laursen |Titel=A Solid-State Edman Degradation |Sammelwerk=J. Am. Chem. Soc. |Band= |Nummer=88 |Datum=1966 |Seiten=5344–5346 |DOI=10.1021/ja00974a069}}</ref> Ebenso werden auf einer [[PVDF]]-Membran immobilisierte Proteine aus einem [[Western Blot]] verwendet, sofern nur Blockierungslösungen ohne Proteine verwendet wurden. Durch eine Verwendung von 4-''N'',''N''-Dimethylaminoazobenzen-4'-Isothiocyanat ([[DABITC]]) sind farbige Aminosäurederivate erhältlich, was eine Analyse per [[Dünnschichtchromatographie]] erleichtert.<ref>J. Y. Chang, E. H. Creaser: ''A novel manual method for protein-sequence analysis.'' In: ''Biochem J.'' 157, Nr. 1, 1976, S. 77–85, PMID 822842, {{PMC|1163818}}.</ref> Durch eine Verwendung von 4-(1'-Cyanoisoindolyl)-phenylisothiocyanat können auch [[Phosphorylierung|phosphorylierte]] Aminosäuren nachgewiesen werden.<ref>Takayuki Shibata, Moses N. Wainaina, Takayuki Miyoshi, Tsutomu Kabashima, Masaaki Kai: ''A manual sequence method of peptides and phosphopeptides using 4-(1'-cyanoisoindolyl)phenylisothiocyanate.'' In: ''Journal of Chromatography A.'' 1218, Nr. 24, 2011, S. 3757–3762, [[doi:10.1016/j.chroma.2011.04.040]], PMID 21531425.</ref>

Außerdem hat der Edman-Abbau eine Anwendung in der Synthese von 2-Iminohydantoinen gefunden. Diese Reaktion soll hier exemplarisch mit der Reaktion von <small>L</small>-[[Leucin]]amid und 2-Bromphenyl-isothiocyanat dargestellt werden. Bei dieser Synthese können Reinheiten des Produktes von bis zu 99 % erreicht werden.<ref>{{Literatur |Autor=Ghotas Evindar, Robert A. Batey |Titel=Peptide Heterocycle Conjugates: A Diverted Edman Degradation Protocol for the Synthesis of N-Terminal 2-Iminohydantoins |Sammelwerk=Org. Lett |Band=5 |Nummer=8 |Datum=2003 |Seiten=1201–1204 |DOI=10.1021/ol034032d}}</ref>

[[Datei:Beispiel Edman Version 3.png|zentriert|rahmenlos|hochkant=2.8|Beispiel Edman-Abbau]]

== Einzelnachweise ==
<references />

[[Kategorie:Protein-Methode]]
[[Kategorie:Namensreaktion]]
[[Kategorie:Biochemisches Nachweisverfahren]]

Edman-Abbau - Versionsgeschichte

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