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[[Datei:ELISPOT-en.png|mini|Schematisches Prinzip des ELISPOTs]]

Der '''ELISpot Assay''' (''Enzyme Linked Immuno Spot Assay'') dient zum [[Nachweis (Chemie)|Nachweis]] [[Sekretion|sezernierter]] [[Zytokin]]e oder [[Antikörper]], die von einzelnen [[Immunsystem|Immunzellen]] nach Stimulation mit [[Antigen]]en sezerniert und an einer [[Membran (Trennschicht)|Membran]] immobilisiert werden.<ref>{{cite journal |author=Czerkinsky C, Nilsson L, Nygren H, Ouchterlony O, Tarkowski A |date=1983 |title=A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells |journal=J Immunol Methods |volume=65 |issue=1–2 |pages=109–121 |doi=10.1016/0022-1759(83)90308-3 |pmid=6361139 |language=en}}</ref>

== Stimulation ==
Die selektive Bindung der sezernierten Proteine erfolgt analog zum [[ELISA]], jedoch mit auf einer undurchsichtigen Membran (meistens aus [[PVDF]]) immobilisierten [[Antikörper]]n (engl. {{lang|en|''coating antibody''}} oder auch {{lang|en|''capture antibody''}}). Nach der Beschichtung der Membranen im [[Mikrotiterplatte]]nformat mit dem Erstantikörper werden die verbliebenen unspezifischen Proteinbindungsstellen der Membranen mit sterilen [[Fetales Kälberserum|FCS]]- oder [[Bovines Serumalbumin|BSA]]-Lösungen blockiert. Die beschichteten Platten werden im Anschluss mit den sezernierenden Zellen und einem zu untersuchenden Stimulus (z. B. ein [[Antigen]] oder ein daraus abgeleitetes [[Peptid]]) versehen. Meistens werden circa 250.000 [[PBMC]] pro Vertiefung einer 96-Loch-ELISpot-Platte eingesetzt. Die sezernierten Zytokine oder Antikörper binden an den immobilisierten Erstantikörper. Nach einer erschütterungsfreien Inkubationsdauer, üblicherweise zwischen 16 Stunden und 48 Stunden, werden die Zellen entfernt und die Detektion kann unter unsterilen Bedingungen erfolgen. Bei Erschütterungen kommt es bei nicht-adhärenten Zellen (synonym: [[Suspensionszellen]]) zu Lateralbewegungen und zu einer fälschlicherweise erhöhten Anzahl an Spots.

== Detektion ==
{{Hauptartikel|Immunmarkierung}}
Nach der Inkubationsdauer werden die Zellen entfernt und eine [[Immunfärbung]] der sezernierten Zytokine oder Antikörper durchgeführt. Die Detektion erfolgt über die selektive Bindung eines zweiten, meistens [[biotin]]ylierten Antikörpers gegen ein anderes Epitop des nachzuweisenden Zytokins, meistens gefolgt von der Bindung eines [[Streptavidin]]s mit gekoppeltem [[Reporterenzym]] und dem [[Fällung|Ausfallen]] eines [[Farbstoff]]s an der Sekretionsstelle.

Zur Messung der Reaktion einer [[Zelluläre Immunantwort|zellulären Immunantwort]] wird als Zytokin oftmals [[Interferon-γ]] gemessen. Durch ein [[Substrat (Biochemie)|Farbstoffsubstrat]] umsetzendes [[Enzym]], welches an den zweiten Antikörper oder an einen weiteren Signalamplifikator (z. B. biotinylierte Detektionsantikörper und Avidin-Konjugate oder Detektionsantikörper und polyklonale anti-Fc-Antikörper-Konjugate) gekoppelt ist, fällt der Farbstoff an der [[Sekretion]]sstelle aus. Dies erlaubt je nach Farbstoff eine Darstellung der Zytokine als kleine rote ([[Naphthol-AS-MX-Phosphat]]/[[Fast Red TR]] oder H2O2/[[3-Amino-9-ethylcarbazol|AEC]]), braune (mit H2O2 und [[3,3′-Diaminobenzidin|DAB]] oder [[3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin|TMB]]) oder blaue Punkte (mit [[Nitroblautetrazoliumchlorid|NBT]]/[[5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat|BCIP]]), mit einem Durchmesser von 75 bis 400 µm sichtbar zu machen. Durch Vergleich mit den entsprechenden [[Negativkontrolle]]n (mit einem irrelevanten Antigen oder Peptid) kann eine Reaktion nachgewiesen werden. Eine [[Positivkontrolle]] mit einem [[Mitogen]] wie [[Pokeweed Mitogen]] (PWM) oder [[Phorbol-12-myristat-13-acetat]] (PMA) zeigt die erfolgreiche Durchführung des ELISpots an, beispielsweise ob die verwendeten Zellen noch lebend waren. Das Mitogen erzeugt eine Antigen-unabhängige Aktivierung der Zellen und eine folgende Sekretion des gesuchten Immunbotenstoffs. Die automatische Auszählung mittels Kamera und Software bestimmt bei den gefärbten und getrockneten Platten, wie viele der eingesetzten Zellen in jedem Ansatz reagierten und mit welcher Intensität (Spotfläche, Spot-Farbsättigung) sie reagierten.

Diese Methode findet unter anderem in der [[Diagnostik]] von [[Autoimmunerkrankung]]en, [[Transplantation]]srisiken, [[Allergie]]n und [[Infektionskrankheit]]en oder auch in der [[Impfstoffentwicklung]] Anwendung. Bei [[T-Zelle]]n und [[B-Zelle]]n werden ELISpots zur Messung von Zytokinreaktionen nach Peptidstimulation durchgeführt, um immunogene T- und B-Zell-Epitope zu identifizieren (engl. {{lang|en|''epitope mapping''}} für ‚[[Epitopkartierung]]‘). Durch ELISPOT identifizierte Epitope sind z. B. in der [[IEDB]] registriert.

== Einzelnachweise ==
<references />

== Weblinks ==
* [http://www.mabtech.com/main/Page.asp?PageId=16&PageName=About+ELISpot Flash-Animation der ELISPOT Verfahren (in Englisch)]
* [http://www.immunospot.eu/elispot-animation.html Eine animierte Illustration des ELISPOT-Prozesses]

{{SORTIERUNG:Elispot}}
[[Kategorie:Immunchemisches Testverfahren]]
[[Kategorie:Abkürzung|ELISPOT]]

ELISpot - Versionsgeschichte

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