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2026-03-09T06:40:42Z

Didesoxymethode nach Sanger: Nutze Vorlage Patent

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'''DNA-Sequenzierung''' ist die Bestimmung der [[Nukleotide|Nukleotid]]-Abfolge in einem [[Desoxyribonukleinsäure|DNA]]-[[Molekül]]. Die DNA-Sequenzierung hat die biologischen Wissenschaften revolutioniert und die Ära der [[Genomik]] eingeleitet. Seit 1995 konnte durch DNA-Sequenzierung das [[Genom]] von über 50.000 (Stand: 2020) verschiedenen Organismen [[Liste von sequenzierten eukaryontischen Genomen|analysiert]] werden.
Zusammen mit anderen [[DNA-Analyse|DNA-analytischen]] Verfahren wird die DNA-Sequenzierung u. a. auch zur Untersuchung [[Erbkrankheit|genetisch bedingter Erkrankungen]] herangezogen. Darüber hinaus ist die DNA-Sequenzierung als [[Analyse|analytische]] Schlüsselmethode, insbesondere im Rahmen von [[Klonierung|DNA-Klonierungen]] (engl. ''molecular cloning''), aus einem [[Molekularbiologie|molekularbiologischen]] bzw. [[Gentechnik|gentechnischen]] [[Labor]]betrieb heute nicht mehr wegzudenken.

== Problemstellung ==
Die DNA-Sequenzierung als Ablesen der Nukleotidfolge von DNA war über Jahrzehnte hinweg bis in die Mitte der 1970er Jahre ein ungelöstes Problem, bis entsprechende biochemische bzw. biotechnologische Methoden entwickelt wurden. Heutzutage ist selbst die Sequenzierung ganzer Genome vergleichsweise schnell und einfach geworden.<ref name="pmid18992322">{{Literatur |Autor=E. Pettersson, J. Lundeberg, A. Ahmadian |Titel=Generations of sequencing technologies |Sammelwerk=Genomics |Band=93 |Nummer=2 |Datum=2009-02 |Seiten=105–111 |DOI=10.1016/j.ygeno.2008.10.003 |PMID=18992322}}</ref>

Die Herausforderungen einer Genomsequenzierung beschränken sich jedoch nicht nur auf das direkte Ablesen der Nukleotidsequenz. Je nach Verfahren werden in jeder einzelnen Sequenzierreaktion auf Grund technischer Beschränkungen nur kurze DNA-Abschnitte (engl. ''reads'') bis maximal 1000 [[Basenpaar]]e abgelesen. Nach Erhalt der Sequenz wird dann der nächste [[Primer]] (mit einer Sequenz aus dem Ende der vorigen Sequenzierung) hergestellt, was als ''{{lang|en|Primer Walking}}'' oder bei ganzen [[Chromosom]]en als ''{{lang|en|[[Chromosome Walking|chromosome walking]]}}'' bezeichnet wird und 1979 erstmals angewendet wurde.<ref>A. C. Chinault, J. Carbon: ''Overlap hybridization screening: isolation and characterization of overlapping DNA fragments surrounding the leu2 gene on yeast chromosome III.'' In: ''Gene.'' Band 5(2), 1979, S. 111–126. PMID 376402.</ref>

Ein größeres Sequenzierprojekt, wie das [[Humangenomprojekt]], bei dem mehrere Milliarden Basenpaare sequenziert wurden, erfordert darum eine Herangehensweise, die als [[Shotgun Sequencing]] bezeichnet wird. Dabei werden längere DNA-Abschnitte zunächst in kleinere Einheiten zerlegt, diese dann sequenziert und die Sequenzinformationen der einzelnen kurzen Abschnitte anschließend mit [[Bioinformatik|bioinformatischen]] Methoden wieder zu einer vollständigen Gesamtsequenz zusammengefügt. Um aus den rohen Sequenzdaten biologisch relevante Informationen zu gewinnen (beispielsweise Informationen über vorhandene [[Gen]]e und deren Kontrollelemente), schließt sich an die Sequenzierung die [[DNA-Sequenzanalyse]] an. Ohne sie bleibt jede Sequenzinformation ohne wissenschaftlichen Wert.

== Sequenzierungsmethoden ==
[[Datei:DNA-Sequencers from Flickr 57080968.jpg|mini|DNA-Sequenzierungsgeräte (2005)]]
Es gibt heute mehrere Verfahren zum Ablesen der Sequenzinformation von einem DNA-Molekül. Lange Zeit waren überwiegend Weiterentwicklungen der Methode nach [[Frederick Sanger]] in Verwendung. Moderne Verfahren bieten Möglichkeiten der beschleunigten Sequenzierung durch hochparallelen Einsatz. Die nach der Sanger-Methode entwickelten Sequenzierungsverfahren werden häufig als ''Sequenzierung der nächsten Generation'' ([[Englische Sprache|engl.]] ''next generation sequencing'', NGS) bezeichnet. Die ''Sequenzierung der dritten Generation'' wird nach dem Englishen ''Third Generation Sequencing'' auch als TGS bezeichnet.

=== Klassische Methoden ===
==== Methode von Maxam und Gilbert ====
Die Methode von [[Allan Maxam]] und [[Walter Gilbert]] von 1977 beruht auf der ''basenspezifischen chemischen Spaltung'' der DNA durch geeignete Reagenzien und anschließender Auftrennung der Fragmente durch denaturierende [[Polyacrylamid-Gelelektrophorese]].<ref>A. Maxam, W. Gilbert: ''A new method of sequencing DNA.'' In: ''[[Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A.]]'' Band 74, 1977, S. 560–564. PMID 265521; {{PMC|392330}}.</ref> Die DNA wird zunächst an einem 5' oder 3'-Ende mit [[Radioaktivität|radioaktivem]] Phosphat oder einem nicht-radioaktiven Stoff ([[Biotin]], [[Fluorescein]]) markiert. In vier getrennten Ansätzen werden dann jeweils bestimmte Basen vom Zucker-Phosphat-Rückgrat der DNA partiell (limitiert) modifiziert und abgespalten, beispielsweise wird die Base [[Guanin]] (G) durch das Reagenz [[Dimethylsulfat]] methyliert und durch Alkalibehandlung mit [[Piperidin]] entfernt. Danach wird der DNA-Strang komplett gespalten. In jedem Ansatz entstehen Fragmente unterschiedlicher Länge, deren 3'-Ende stets an bestimmten Basen gespalten worden war. Die denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese trennt die Fragmente nach der Länge auf, wobei Längenunterschiede von einer Base aufgelöst werden. Durch Vergleich der vier Ansätze auf dem Gel lässt sich die Sequenz der DNA ablesen. Ihren Erfindern ermöglichte diese Methode die Bestimmung der [[Operon]]-Sequenz eines Bakteriengenoms. Die Methode kommt heute kaum noch zum Einsatz, da sie gefährliche Reagenzien benötigt und schwerer automatisierbar ist als die zur gleichen Zeit entwickelte Didesoxymethode nach Sanger.

==== Didesoxymethode nach Sanger ====
Die [[Frederick Sanger#Methode zur Sequenzierung von Nukleinsäuren|Didesoxymethode nach Sanger]] wird auch ''Kettenabbruch-Synthese'' genannt. Sie stellt eine [[Enzym|enzymatische]] Methode dar. Sie wurde von [[Frederick Sanger|Sanger]] und [[Alan Coulson|Coulson]] um 1975 entwickelt und bereits 1977 mit der ersten vollständigen Sequenzierung eines [[Genom]]s ([[Bakteriophage]] [[Enterobakteriophage PhiX174|φX174]])<ref>F. Sanger et al.: ''Nucleotide sequence of bacteriophage phi X174 DNA.'' In: ''[[Nature]].'' Band 265, 1977, S. 687–695. [[doi:10.1038/265687a0]];PMID 870828.</ref> vorgestellt.<ref>F. Sanger et al.: ''DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.'' In: ''Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A.'' Band 74, 1977, S. 5463–5467. PMID 271968; {{PMC|431765}}.</ref> Sanger erhielt für seine Arbeiten zur DNA-Sequenzierung zusammen mit Walter Gilbert und [[Paul Berg]] 1980 den [[Nobelpreis für Chemie]].<ref>{{nobel-ch|1980|Walter Gilbert, Paul Berg und Frederick Sanger}}</ref>

[[Datei:Didesoxy-Methode.svg|mini|360px|Prinzip der DNA-Sequenzierung nach der Didesoxy-Methode.<br /> dNTP ist die allgemeine Abkürzung für ein [[Nukleosidtriphosphat]] und kann für dATP, dCTP, dGTP oder dTTP stehen. [[ddNTPs]] sind die entsprechenden Didesoxy-Varianten der dNTPs. Der Einbau eines ddNTPs führt zum Abbruch der Polymerisationsreaktion. Die blauen Punkte am 5'-Ende des Primers stellen eine Markierung dar (z. B. eine fluoreszierende Gruppe), mittels der die Syntheseprodukte später im Gel sichtbar gemacht werden können. Alternativ lassen sich auch radioaktiv markierte Nukleosidtriphosphate zur Polymerisationsreaktion einsetzen.]]

Ausgehend von einem kurzen Abschnitt bekannter Sequenz ([[Primer]]) wird durch eine [[DNA-Polymerase]] einer der beiden komplementären DNA-Stränge verlängert. Zunächst wird die DNA-Doppelhelix durch Erwärmung denaturiert, woraufhin Einzelstränge für das weitere Vorgehen zur Verfügung stehen. In vier sonst gleichen Ansätzen (alle beinhalten die vier Nukleotide, von denen eines radioaktiv markiert ist<ref>F. Sanger, A. R. Coulson: ''A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase.'' In: ''[[Journal of Molecular Biology]].'' Band 93, 1975, S. 441–448. PMID 1100841.</ref>) wird je eine der vier Basen zum Teil als [[Didesoxynukleosidtriphosphat]] (ddNTP) zugegeben (also je ein Ansatz mit entweder ddATP, ddCTP, ddGTP oder ddTTP). Diese ''Kettenabbruch''-ddNTPs besitzen keine 3'-Hydroxygruppe: Werden sie in den neusynthetisierten Strang eingebaut, ist eine Verlängerung der DNA durch die DNA-Polymerase nicht mehr möglich, da die OH-Gruppe am 3'-C-Atom für die Verknüpfung mit der Phosphatgruppe des nächsten Nukleotids fehlt. In der Folge entstehen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge, die in jedem einzelnen Ansatz stets mit dem gleichen ddNTP enden (also je Ansatz nur mit A oder C oder G oder T). Nach der Sequenzier-Reaktion werden die markierten Abbruchprodukte aus allen Ansätzen mittels [[Polyacrylamid-Gelelektrophorese]] der Länge nach aufgetrennt. Durch Vergleich der vier Ansätze kann man die Sequenz nach der Exposition des radioaktiven Gels auf einem [[Fotografischer Film|fotografischen Film]] ([[Röntgenfilm]]) ablesen. Die dementsprechend komplementäre Sequenz ist die Sequenz der verwendeten einsträngigen DNA-[[Matrize (Genetik)|Matrize]].
Als Sequenzier-Reaktion kommt heutzutage eine Variation der [[Polymerase-Kettenreaktion]] (PCR) zum Einsatz. Anders als bei der PCR wird nur ein Primer eingesetzt, sodass die DNA nur linear amplifiziert wird.

Ein radioaktives Verfahren zur DNA-Sequenzierung, durch den Transfer der DNA Moleküle auf einen Träger während der elektrophoretischen Auftrennung, wurde von Fritz M. Pohl und seiner Arbeitsgruppe Anfang der 1980er Jahre entwickelt.<ref name="PMID6396083">S. Beck, F. M. Pohl: ''DNA sequencing with direct blotting electrophoresis.'' In: ''[[The EMBO journal]].'' Band 3, Nummer 12, Dezember 1984, S. 2905–2909. PMID 6396083. {{PMC|557787}}.</ref><ref>{{Patent| Land=DE| V-Nr=3022527| Code=C2| Titel=Verfahren zur Durchführung einer Elektrophorese sowie Vorrichtung dazu| A-Datum=1980-06-16| V-Datum=1985-01-31| Erfinder=Fritz Pohl}}</ref> Die Vermarktung des „Direct-Blotting-Electrophoresis System GATC 1500“, erfolgte durch das Konstanzer Unternehmen GATC Biotech. Der DNA-Sequenzierer wurde z. B. im Rahmen des europäischen Genomprojekts zur Sequenzierung des Chromosoms II der Hefe ''[[Saccharomyces cerevisiae]]'' eingesetzt.<ref name="PMID7813418">H. Feldmann, M. Aigle et al..: ''Complete DNA sequence of yeast chromosome II.'' In: ''The EMBO journal.'' Band 13, Nummer 24, Dezember 1994, S. 5795–5809, PMID 7813418. {{PMC|395553}}.</ref>

Seit Anfang der 1990er Jahre werden vor allem mit [[Fluoreszenz|Fluoreszenz-Farbstoffen]] [[Fluoreszenzmarkierung|markierte]] Didesoxynukleosidtriphosphate eingesetzt. Jedes der vier ddNTPs wird mit einem unterschiedlichen Farbstoff gekoppelt. Diese Modifikation erlaubt es, alle vier ddNTPs in einem Reaktionsgefäß zuzugeben, eine Aufspaltung in getrennte Ansätze und der Umgang mit [[Radioisotop]]en entfällt. Die entstehenden Kettenabbruchprodukte werden mittels [[Kapillarelektrophorese]] aufgetrennt und mit Hilfe eines Lasers zur Fluoreszenz angeregt. Die ddNTPs am Ende jedes DNA-Fragmentes zeigen dadurch Fluoreszenz unterschiedlicher Farbe und können so von einem Detektor erkannt werden. Das Elektropherogramm (die Abfolge der Farbsignale, die am Detektor erscheinen) gibt direkt die Sequenz der Basen des sequenzierten DNA-Stranges wieder.

=== Moderne Ansätze ===
Mit der zunehmenden Bedeutung der DNA-Sequenzierung in der Forschung und Diagnostik wurden Methoden entwickelt, die einen erhöhten Durchsatz erlauben. Damit ist es nun möglich, das komplette menschliche Genom in etwa 8 Tagen zu sequenzieren.<ref>{{Internetquelle |url=http://www.nature.com/news/2009/090206/full/news.2009.86.html |titel=Genome sequencing: the third generation |datum=2009-02-06 |sprache=en |abruf=2011-02-28}}</ref> Die entsprechenden Verfahren werden als ''Sequenzierung der zweiten Generation'' ([[Englische Sprache|engl.]] ''second generation sequencing'') bezeichnet. Verschiedene Firmen haben Verfahren mit unterschiedlichen Vor- und Nachteilen entwickelt. Außer den hier aufgeführten gibt es noch weitere. Die DNA-Sequenzierung der zweiten Generation wurde von der Zeitschrift [[Nature Methods]] zur Methode des Jahres 2007 gekürt.<ref name="DOI10.1038/nmeth1153">Anonym: ''Method of the Year.'' In: ''Nature Methods.'' 5, 2008, S. 1, [[doi:10.1038/nmeth1153]].</ref> Im Gegensatz zur DNA-Sequenzierung nach Sanger werden in einem Reaktionsgefäß parallel mehrere Sequenzen bestimmt, allerdings nur von kurzen Fragmenten. Diese werden aufgrund von Sequenzüberlappungen durch eine Software (''[[in silico]]'') zusammengefügt. Dadurch können beispielsweise in der [[Onkologie]] Mutationen in einer Mischung mit unmutierten Sequenzen mit einer Sensitivität von unter 1 % nachgewiesen werden, während die Sensitivität für Mutationen bei der Sanger-Methode bei etwa 10 % liegt. Je öfter die Fragmente sequenziert werden (d. h. je besser die ''Coverage''), desto besser wird die Sensitivität.

==== Pyrosequenzierung ====
[[Datei:ABI 3100 Interferogram OpenChrom Community Edition Alder.png|mini|Rohdaten (mittig) samt DNA-Sequenz (rechts) dargestellt in [[OpenChrom]]]]
Die Pyrosequenzierung nutzt wie die Sanger-Sequenzierung eine [[DNA-Polymerase]] zur Synthese des DNA-Gegenstranges,<ref>M. Ronaghi: ''Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing.'' In: ''Genome Research.'' 11, 2001, S. 3–11. PMID 11156611, [[doi:10.1101/gr.11.1.3]] [http://genome.cshlp.org/cgi/reprint/11/1/3.pdf (PDF)] (PDF; 685 kB).</ref> wobei der Typ der DNA-Polymerase durchaus noch unterschiedlich sein kann. Die DNA-Mischung wird mit einem DNA-Adapter ligiert und über eine komplementäre Adaptersequenz an ''{{lang|en|beads}}'' gekoppelt. Die mit DNA beladenen ''{{lang|en|beads}}'' werden auf eine Platte mit Poren von der Größe eines ''{{lang|en|beads}}'' gegeben, bei der unter jeder Pore ein Lichtleiter zu einem Detektor führt. Die DNA-Polymerase wird gewissermaßen „in Aktion“ beobachtet, wie sie nacheinander einzelne Nukleotide an einen neusynthetisierten DNA-Strang anhängt. Der erfolgreiche Einbau eines Nukleotids wird durch ein ausgeklügeltes [[Enzym]]system unter Beteiligung einer [[Luziferase]] in einen Lichtblitz umgesetzt und von einem Detektor erfasst. Die zu sequenzierende DNA dient als Matrizenstrang und liegt einzelsträngig vor. Ausgehend von einem [[Primer]] erfolgt die Strangverlängerung, Nukleotid um Nukleotid, durch Zugabe von jeweils einer der vier Arten der [[Desoxynukleosid]]triphosphate (dNTP). Bei Zugabe des passenden (komplementären) Nukleotids erhält man ein Signal. Wurde ein an dieser Stelle nicht passendes NTP zugegeben, bleibt der Lichtblitz aus. Danach werden die vorhandenen NTP zerstört, und eine andere Art wird zugesetzt; dies wird fortgesetzt, bis sich wieder eine Reaktion zeigt; spätestens nach der vierten Zugabe zeigt sich eine Reaktion, da dann alle Arten von NTP durchprobiert wurden.

Bei Einbau eines komplementären Nukleotids durch die DNA-Polymerase wird [[Pyrophosphat]] (PP<sub>i</sub>) freigesetzt. Das Pyrophosphat wird durch die ATP-Sulfurylase zu [[Adenosintriphosphat]] (ATP) umgesetzt. Das ATP treibt die Luziferase-Reaktion an, wodurch Luziferin in Oxyluziferin umgesetzt wird. Dies resultiert wiederum in einem detektierbaren Lichtsignal – dessen Stärke proportional zum verbrauchten ATP ist.

Die Pyrosequenzierung wird beispielsweise zur Bestimmung der Häufigkeit von bestimmten Genmutationen (SNPs, engl. ''[[Einzelnukleotid-Polymorphismus|Single Nucleotide Polymorphism]]''), z. B. bei der Untersuchung von Erbkrankheiten eingesetzt. Die Pyrosequenzierung ist gut automatisierbar und eignet sich zur hochparallelen Analyse von DNA-Proben.

Pyrosequenzierung wurde Mitte der 1990er Jahre von [[Mathias Uhlén]], [[Mostafa Ronaghi]] und [[Pål Nyrén]] entwickelt (Nyrén erhielt dafür 2013 den [[Europäischer Erfinderpreis|Europäischen Erfinderpreis]]) und ab 1999 von [[Jonathan Rothberg]] in der 454 GS FLX der Firma [[Jonathan M. Rothberg#454 Life Sciences|454 Life Sciences]] mit Chip-Technologie umgesetzt (siehe Ionen-Halbleiter-DNA-Sequenzierungssystem), die 2005 als erste Next Generation Plattform auf den Markt kam (aufgekauft von Roche Diagnostics 2007).<ref name="chi">Kelly Rae Chi, The year of sequencing, Nature Methods, Band 5, Januar 2008, S. 11–14.</ref> Mit der 454 GS FLX gelang es 2007 das Genom von [[James Watson]], der die Doppelhelixstruktur der DNA 1953 mit [[Francis Crick]] entdeckte, in nur 2 Monaten zu sequenzieren, während das 2003 abgeschlossene erste Human Genome Project noch 13 Jahren benötigte.<ref name="epo">[https://www.epo.org/news-events/events/european-inventor/finalists/2013/nyren/feature.html Pål Nyrén, inventor of Pyrosequencing], Europäisches Patentamt 2013.</ref>

==== Sequenzierung durch Hybridisierung ====
Zu diesem Zweck werden auf einem Glasträger ([[DNA-Chip]] oder [[Microarray]]) kurze DNA-Abschnitte ([[Oligonukleotide]]) in Reihen und Spalten fixiert. Die Fragmente der zu sequenzierenden DNA werden mit Farbstoffen markiert und das Fragmentgemisch wird auf der Oligonukleotidmatrix aufgebracht, so dass komplementäre fixierte und freie DNA-Abschnitte miteinander hybridisieren können. Nach dem Auswaschen ungebundener Fragmente lässt sich das Hybridisierungsmuster anhand der Farbmarkierungen und deren Stärke ablesen. Da die Sequenzen der fixierten Oligonukleotide und deren Überlappungsbereiche bekannt sind, kann man letztlich aus dem Farbmuster auf die zugrundeliegende Gesamtsequenz der unbekannten DNA rückschließen.

==== Ionen-Halbleiter-DNA-Sequenzierungssystem ====
{{Hauptartikel|Halbleitersequenzierung}}
Dieses Verfahren von ''Ion Torrent'' nutzt [[Halbleiter]]verfahren, um mittels [[Integrierter Schaltkreis|integrierter Schaltkreise]] eine unmittelbare nicht-optische [[Genom]]-Sequenzierung durchzuführen.
Dabei werden die Sequenzierungsdaten direkt über die Halbleiterchip-Detektion von [[Ion]]en gewonnen, die von vorlageabhängigen DNA-Polymerasen produziert werden. Der dafür verwendete Chip besitzt ionensensitive [[Feldeffekttransistor]]-Sensoren, die in einem Raster von 1,2 Mio. Vertiefungen angeordnet sind, in denen die Polymerase-Reaktion stattfindet. Dieses Raster ermöglicht parallele und simultane Detektion unabhängiger Sequenzreaktionen.
Dabei kommt die komplementäre Metalloxid-Halbleiter-Technologie ([[Complementary Metal Oxide Semiconductor|CMOS]]) zum Einsatz, die eine kostengünstige Reaktion in hoher Messpunkt-Dichte erlaubt.<ref>J. M. Rothberg, W. Hinz, T. M. Rearick, J. Schultz, W. Mileski, M. Davey, J. H. Leamon, K. Johnson, M. J. Milgrew, M. Edwards, J. Hoon, J. F. Simons, D. Marran, J. W. Myers, J. F. Davidson, A. Branting, J. R. Nobile, B. P. Puc, D. Light, T. A. Clark, M. Huber, J. T. Branciforte, I. B. Stoner, S. E. Cawley, M. Lyons, Y. Fu, N. Homer, M. Sedova, X. Miao, B. Reed, J. Sabina, E. Feierstein, M. Schorn, M. Alanjary, E. Dimalanta, D. Dressman, R. Kasinskas, T. Sokolsky, J. A. Fidanza, E. Namsaraev, K. J. McKernan, A. Williams, G. T. Roth, J. Bustillo: ''An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing.'' In: ''Nature.'' 475(7356), 20. Jul 2011, S. 348–352, [[doi:10.1038/nature10242]].</ref>

Ein erster solcher Chip wurde von Jonathan Rothberg entwickelt für die erste Next-Generation-Plattform, die 454 GS FlX, die Pyrosequenzierung benutzt (siehe oben).

==== Sequenzierung mit Brückensynthese ====
Die zu sequenzierende doppelsträngige DNA wird bei der Sequenzierung mit Brückensynthese von ''Solexa/Illumina'' an beiden Enden mit je einer unterschiedlichen Adapter-DNA-Sequenz ligiert. Anschließend wird die DNA denaturiert, nach Verdünnung einzelsträngig auf eine Trägerplatte ligiert und per Brückenamplifikation ''[[in situ]]'' vervielfältigt.<ref>E. R. Mardis: ''The impact of next-generation sequencing technology on genetics.'' In: ''Trends Genet.'' Band 24(3), 2008, S. 133–141. [[doi:10.1016/j.tig.2007.12.007]]. PMID 18262675.</ref><ref name="Liu">L. Liu, Y. Li, S. Li, N. Hu, Y. He, R. Pong, D. Lin, L. Lu, M. Law: ''Comparison of next-generation sequencing systems.'' In: ''J Biomed Biotechnol.'' Band 2012, S. 251364. [[doi:10.1155/2012/251364]]. PMID 22829749; {{PMC|3398667}}.</ref> Dadurch entstehen auf der Trägerplatte einzelne Bereiche (''cluster'') mit vervielfältigter DNA, die innerhalb eines ''clusters'' die gleiche Sequenz aufweisen. In einer ''{{lang|en|sequencing by synthesis}}''-verwandten PCR-Reaktion mit vier verschiedenfarbig fluoreszierenden Kettenabbruchsubstraten wird in Echtzeit die jeweils eingebaute Nukleinbase pro Zyklus in einem ''cluster'' bestimmt. Die Methode wurde 1997 durch [[Shankar Balasubramanian]] und [[David Klenerman]] entwickelt, die dafür für 2022 den [[Breakthrough Prize in Life Sciences]] erhielten. Die Methode wurde im Rahmen des Startups Solexa entwickelt, die 2006 von [[Illumina]] übernommen wurden, daher der Name. In die Solexa/Illumina-Methode flossen damals auch die unabhängig in Genf bei [[GlaxoSmithKline]] erstellten Pionierarbeiten von [[Pascal Mayer (Biophysiker)|Pascal Mayer]] ein (insbesondere die Cluster-Vervielfältigung), der dafür ebenfalls den Breakthrough Prize erhielt. Die Plattform von Solexa kam 2007 auf den Markt und machte später Illumina zum Marktführer.

==== Zwei-Basen-Sequenzierung ====
Die Zwei-Basen-Sequenzierung (engl. ''{{lang|en|Sequencing by Oligo Ligation Detection}}'', SOLiD) von ''Applied Biosystems'' ist eine Variante der {{lang|en|Sequencing by Ligation}}.<ref name="Liu" /><ref>J. Henson, G. Tischler, Z. Ning: ''Next-generation sequencing and large genome assemblies.'' In: ''[[Pharmacogenomics]].'' Band 13(8), 2012, S. 901–915. [[doi:10.2217/pgs.12.72]]. PMID 22676195. [http://www.futuremedicine.com/doi/pdfplus/10.2217/pgs.12.72 (PDF)].</ref> Eine DNA-Bibliothek wird verdünnt und mit einer [[DNA-Polymerase]] an ''microbeads'' gekoppelt, anschließend werden in einer [[Emulsions-PCR]] die DNA vervielfältigt. Dadurch enthält jedes Microbead mehrere Kopien jeweils nur einer DNA-Sequenz. Die ''microbeads'' werden am 3'-Ende modifiziert, wodurch sie einzeln auf einer Trägerplatte befestigt werden können. Nach Bindung von Primern und einer Zugabe von vier verschiedenen spaltbaren [[Hybridisierungssonde|Sonden]], die jeweils farblich unterschiedlich [[Fluoreszenzmarkierung|fluoreszent markiert]] sind und anhand der ersten beiden Nukleotide (CA, CT, GG, GC) an die DNA-Vorlage binden, wird mit einer [[DNA-Ligase]] ligiert. Anschließend werden die Sonden gespalten, wodurch die Markierungen freigesetzt werden. Durch bis zu fünf Primer, die jeweils in der Sequenz um eine Base zurückversetzt sind, wird jede Base in der DNA-Sequenz in mindestens zwei verschiedenen Ligationsreaktionen bestimmt.

Die Methode (die einzige der frühen Plattformen, die [[Ligase]]n benutzten) wurde von [[Kevin McKernan]] bei Applied Biosystems entwickelt und kam im Oktober 2007 als ''SOLiD''-Plattform auf den Markt. Die Ligationsmethode wurde zuvor bei der 2006 von Applied Biosystems übernommenen Firma Agencourt Personal Genomics entwickelt.<ref name="chi"/>

==== Sequenzierung mit gepaarten Enden ====
Ein eindeutig identifizierbares Signal erhält man auch über die Erzeugung von kurzen DNA-Stücken aus dem Anfang und Ende einer DNA-Sequenz (engl. ''{{lang|en|Paired End Tag Sequencing}}'', PETS), wenn das Genom bereits vollständig sequenziert wurde.<ref>X. Ruan, Y. Ruan: ''Genome wide full-length transcript analysis using 5' and 3' paired-end-tag next generation sequencing (RNA-PET).'' In: ''Methods Mol Biol.'' Band 809, 2012, S. 535–562. {{DOI|10.1007/978-1-61779-376-9_35}}. PMID 22113299.</ref><ref>M. J. Fullwood, C. L. Wei, E. T. Liu, Y. Ruan: ''Next-generation DNA sequencing of paired-end tags (PET) for transcriptome and genome analyses.'' In: ''Genome Res.'' Band 19(4), 2009, S. 521–532. [[doi:10.1101/gr.074906.107]]. PMID 19339662. [http://genome.cshlp.org/content/19/4/521.full.pdf+html (PDF)].</ref>

=== Sequenzierung der dritten Generation ===
Die Sequenzierung der dritten Generation misst die Reaktion bei einzelnen Molekülen als [[Einzelmolekülexperiment]], wodurch eine der Sequenzierung vorangehende [[Amplifikation (Genetik)|Amplifikation]] per [[Polymerase-Kettenreaktion|PCR]] entfällt.<ref>F. Ozsolak: ''Third-generation sequencing techniques and applications to drug discovery.'' In: ''[[Expert Opin Drug Discov]].'' Band 7(3), 2012, S. 231–243. [[doi:10.1517/17460441.2012.660145]]. PMID 22468954; {{PMC|3319653}}.</ref><ref>C. S. Pareek, R. Smoczynski, A. Tretyn: ''Sequencing technologies and genome sequencing.'' In: ''J Appl Genet.'' Band 52, Ausgabe 4, 2011, S. 413–435. [[doi:10.1007/s13353-011-0057-x]]. PMID 21698376; {{PMC|3189340}}.</ref> Dadurch wird die ungleichmäßige Amplifikation durch [[thermostabile DNA-Polymerase]]n vermieden, da Polymerasen manche [[DNA-Sequenz]]en bevorzugt binden und diese verstärkt replizieren ({{enS|polymerase bias}}). Dadurch können manche Sequenzen übersehen werden. Weiterhin kann das Genom [[Analyse einzelner Zellen|einzelner Zellen]] untersucht werden ({{enS|single-cell sequencing}} ‚Einzelzell-Sequenzierung‘). Das freigesetzte Signal wird in [[Echtzeit]] aufgenommen. Bei der DNA-Sequenzierung der dritten Generation werden, je nach Verfahren, zwei verschiedene Signale aufgezeichnet: Freigesetzte [[Proton]]en (als Variante der Halbleitersequenzierung) oder [[Fluorophor]]e (mit Fluoreszenzdetektor).<ref name="Liu" /> Die DNA- und RNA-Sequenzierung einzelner Zellen wurde von der Zeitschrift ''[[Nature Methods]]'' zur Methode des Jahres 2013 gekürt.<ref name="DOI10.1038/nmeth.2801">''Method of the Year 2013.'' In: ''Nature Methods.'' 11, 2013, S. 1, [[doi:10.1038/nmeth.2801]].</ref>

==== Nanoporen-Sequenzierung ====
Die Nanoporen-Sequenzierung beruht auf Änderungen des Ionenstromes durch Nanoporen, die in eine künstliche Membran eingelagert sind. Als Nanopore werden sowohl biologische (kleine [[Transmembranprotein]]e ähnlich einem [[Ionenkanal]], z. B. [[α-Hämolysin]] (α-HL) oder [[ClpX]])<ref>J. Nivala, D. B. Marks, M. Akeson: ''Unfoldase-mediated protein translocation through an α-hemolysin nanopore.'' In: ''[[Nature Biotechnology]].'' Band 31, Nummer 3, März 2013, S. 247–250, [[doi:10.1038/nbt.2503]]. PMID 23376966. {{PMC|3772521}}.</ref> als auch synthetische [[Pore]]n (aus [[Siliciumnitrid]] oder [[Graphen]]) sowie halbsynthetische Poren verwendet. Die Nanopore ist eingelassen in eine künstliche Membran, die einen besonders hohen elektrischen Widerstand aufweist. Die Pore ist im Gegensatz zu gewöhnlichen Ionenkanälen permanent geöffnet und erlaubt somit, nach Anlegung eines Potentials, einen konstanten Ionenfluss durch die Membran. DNA-Moleküle, die die Pore passieren, führen zu einer Verringerung des Stromes. Diese Stromabnahme hat eine für jedes Nukleotid spezifische [[Amplitude]], welche gemessen und dem entsprechenden Nukleotid zugeordnet werden kann.

Bei der Einzelstrangsequenzierung wird doppelsträngige DNA durch eine [[Helikasen|Helikase]] getrennt und in die Nanopore eingeführt. Im Falle einer MspA-Pore befinden sich gleichzeitig vier Nukleotide der DNA innerhalb der Pore.<ref>A. H. Laszlo, I. M. Derrington, B. C. Ross, H. Brinkerhoff, A. Adey, I. C. Nova, J. M. Craig, K. W. Langford, J. M. Samson, R. Daza, K. Doering, J. Shendure, J. H. Gundlach: ''Decoding long nanopore sequencing reads of natural DNA.'' In: ''[[Nature Biotechnology]].'' Band 32, Nummer 8, August 2014, S. 829–833, [[doi:10.1038/nbt.2950]]. PMID 24964173. {{PMC|4126851}}.</ref> Die Durchtrittsgeschwindigkeit ist unter anderem von der [[pH-Wert]]-Differenz beidseitig der Membran abhängig.<ref>B. N. Anderson, M. Muthukumar, A. Meller: ''pH tuning of DNA translocation time through organically functionalized nanopores.'' In: ''[[ACS Nano]].'' Band 7, Nummer 2, Februar 2013, S. 1408–1414, [[doi:10.1021/nn3051677]]. PMID 23259840. {{PMC|3584232}}.</ref> Durch die spezifischen Ionenstromänderungen für jedes der vier Nukleotide lässt sich aus dem erhaltenen Datensatz die Sequenz ablesen. Eine Auswertung erfolgt z. B. mit der Software ''Poretools''.<ref>N. J. Loman, A. R. Quinlan: ''Poretools: a toolkit for analyzing nanopore sequence data.'' In: ''Bioinformatics.'' Band 30, Nummer 23, Dezember 2014, S. 3399–3401, [[doi:10.1093/bioinformatics/btu555]]. PMID 25143291.</ref> Der Vorteil der Methode besteht in ihrer Geschwindigkeit und in der gleichbleibenden Genauigkeit auch bei langen DNA-Strängen. Die Methode wird nicht nur für [[Nukleinsäuren]], sondern auch abgewandelt zur [[Proteinsequenzierung]] verwendet.<ref>Y. Yang, R. Liu, H. Xie, Y. Hui, R. Jiao, Y. Gong, Y. Zhang: ''Advances in nanopore sequencing technology.'' In: ''Journal of nanoscience and nanotechnology.'' Band 13, Nummer 7, Juli 2013, S. 4521–4538. PMID 23901471.</ref>

== Literatur ==
* Laura Bonetta: [http://www.nature.com/nmeth/journal/v3/n2/pdf/nmeth0206-141.pdf ''Genome sequencing in the fast lane''.] (PDF; 751 kB) In: ''[[Nature Methods]]'', Band 3, 2006, S. 141–147. [[doi:10.1038/nmeth0206-141]]
* Karin Hollricher: ''Hochleistungs-Sequenzieren.'' In: ''[[Laborjournal (Zeitschrift)|Laborjournal]]'', Nr. 4, 2009, S. 44–48.
* B. A. Peters, B. G. Kermani et al.: ''Accurate whole-genome sequencing and haplotyping from 10 to 20 human cells.'' In: ''[[Nature]]'', Band 487, Nummer 7406, Juli 2012, S. 190–195. [[doi:10.1038/nature11236]]. PMID 22785314. {{PMC|3397394}}.
* M. W. Schmitt, S. R. Kennedy et al..: ''Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing.'' In: ''[[Proceedings of the National Academy of Sciences]].'' Band 109, Nummer 36, September 2012, S. 14508–14513. [[doi:10.1073/pnas.1208715109]]. PMID 22853953. {{PMC|3437896}}.

== Weblinks ==
* [https://www.bfr.bund.de/cm/343/erbmaterial-von-erregern-vergleichen-um-krankheitsausbrueche-aufzuklaeren.pdf ''Erbmaterial von Erregern vergleichen, um Krankheitsausbrüche aufzuklären''.] (PDF; 272 kB) Stellungnahme des [[Bundesinstitut für Risikobewertung|Bundesinstituts für Risikobewertung (BfR)]]

== Einzelnachweise ==
<references />

{{SORTIERUNG:DNASequenzierung}}
[[Kategorie:Biologische Untersuchungsmethode]]
[[Kategorie:Gentechnik]]
[[Kategorie:Nukleinsäure-Methode]]
[[Kategorie:Elektrophorese]]
[[Kategorie:Molekularbiologie]]
[[Kategorie:Biochemisches Nachweisverfahren]]

DNA-Sequenzierung - Versionsgeschichte

imported>Coronium: /* Didesoxymethode nach Sanger */ Nutze Vorlage Patent