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[[Datei:Bradford-BSA-standart.JPG|mini|BSA-Standardreihe von 0 µg links bis 12 µg rechts, mit Coomassie-Blau versetzt, in einer Mikrotiterplatte]]
Der '''Bradford-Test''' ist eine [[Fotometrie|photometrische Methode]] zur quantitativen Bestimmung von [[Protein]]en bis zu Konzentrationen im Bereich [[Mikrogramm]] pro [[Milliliter]].<ref>Bradford, M.M. (1976): ''A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.'' In: ''[[Anal. Biochem.]]'' Bd. 72, S. 248–254. PMID 942051 [[doi:10.1016/0003-2697(76)90527-3]] [https://hoffman.cm.utexas.edu/courses/bradford_assay.pdf PDF].</ref> Er ist nach dem US-amerikanischen Biochemiker [[Marion M. Bradford]] benannt.

== Prinzip ==
[[Datei:BSA Standard Curve.png|mini|Standardkurve mit [[Bovines Serumalbumin|BSA]]-Lösungen]]
Der [[Triphenylmethanfarbstoff]] [[Coomassie-Brillant-Blau|Coomassie-Brillant-Blau G-250]] (CBBG) bildet in [[Säure|saurer Lösung]] mit [[kation]]ischen und unpolaren [[Seitenkette]]n von Proteinen [[Komplexchemie|Komplexe]]. Die ungebundene (kationische), rote Form des Farbstoffs hat im [[Absorptionsspektrum]] ein Maximum bei 470 [[Nanometer#Nanometer|nm]]. Durch die Komplexbildung mit Proteinen wird der Farbstoff in seiner blauen, unprotonierten, [[anion]]ischen [[Sulfonat]]form stabilisiert und das Absorptionsmaximum verschiebt sich von 465 nm auf 595 nm.<ref>Compton, S. J., Jones, C. G.: ''Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay.'' In: ''Anal. Biochem.'' Bd. 151 (1985), S. 369–374. PMID 4096375 [[doi:10.1016/0003-2697(85)90190-3]].</ref><ref name="PMID32238597">C. L. Kielkopf, W. Bauer, I. L. Urbatsch: ''Bradford Assay for Determining Protein Concentration.'' In: ''Cold Spring Harbor protocols.'' Band 2020, Nummer 4, April 2020, S. 102269, {{DOI|10.1101/pdb.prot102269}}, PMID 32238597.</ref> Da der [[Extinktionskoeffizient]] des Farbstoff-Protein-Komplexes außerdem sehr viel höher als der des freien Farbstoffes ist, kann die Zunahme der Absorption bei 595 nm durch die Bildung des Komplexes mit hoher Empfindlichkeit gegen das freie Farbreagenz photometrisch gemessen werden und ist ein Maß für die Proteinkonzentration der Lösung.

Das Maß der Farbreaktion ist vom Protein abhängig; deshalb wird zur Konzentrationsbestimmung eines bestimmten Proteins eine [[Kalibrierung]] notwendig. Steht diese nicht zur Verfügung oder soll die Konzentration eines Proteingemischs bestimmt werden, werden Standardproteine zur Kalibrierung genutzt (z. B. [[Chymotrypsin]], [[Lysozym]] oder [[Bovines Serumalbumin|BSA]]). Dabei können je nach Zusammensetzung des Proteingemisches für gleiche Proteinmengen unterschiedliche Ergebnisse erhalten werden. Somit ist die Bradfordbestimmung hier ungenau. Ihre Vorteile sind ihre hohe Sensitivität und die einfache und schnelle Durchführung. Die [[Bestimmungsgrenze]] des Mikrotests beträgt 1–20 µg/ml, des Makrotests 20–200 µg/ml Protein. In neueren Formulierungen können 0,2 µg detektiert werden.<ref name="PMID25837770">K. Grintzalis, C. D. Georgiou, Y. J. Schneider: ''An accurate and sensitive Coomassie Brilliant Blue G-250-based assay for protein determination.'' In: ''Analytical biochemistry.'' Band 480, Juli 2015, S. 28–30, {{DOI|10.1016/j.ab.2015.03.024}}, PMID 25837770.</ref> Die Messung erfolgt in einem [[Photometer]] oder per Digitalfotografie.<ref name="PMID37747186">D. C. Moreira: ''RGBradford: Protein Quantitation with a Smartphone Camera.'' In: ''Journal of visualized experiments : JoVE.'' Nummer 199, September 2023, {{DOI|10.3791/65547}}, PMID 37747186.</ref>

== Störende Substanzen ==
Der Bradford-Test wird bereits durch geringe Konzentrationen von Detergenzien wie z. B. [[Natriumlaurylsulfat|SDS]] gestört. Die Bindung von Coomassie-Brillant-Blau an das [[Tensid]] SDS erzeugt einen stabilen Komplex und stabilisiert die grüne Form mit der Nettoladung 0, weshalb SDS eine Störsubstanz bei photometrischen Bestimmungen nach Bradford ist.<ref name="PMID4096375">S. J. Compton, C. G. Jones: ''Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay.'' In: ''Analytical biochemistry.'' Band 151, Nummer 2, Dezember 1985, S. 369–374, {{DOI|10.1016/0003-2697(85)90190-3}}, PMID 4096375.</ref> Detergenzien binden ebenfalls an das Protein und konkurrieren mit dem Farbstoff um Bindungsstellen bzw. verdrängen ihn vom Protein, wodurch die Farbreaktion verhindert wird. Hingegen haben [[Chaotrope Verbindung|chaotrope Verbindungen]] wie z. B. [[Guanidiniumchlorid]], Reduktionsmittel wie DTT ([[Dithiothreitol]]) oder [[Chelator|Chelatoren]] keinen Einfluss auf das Ergebnis.<ref>Bio-Rad Laboratories: [http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf ''Quick Start Bradford Assay Instruction Manual'']. S. 7.</ref> Wenn Detergenzien nicht aus den Proteinproben eliminiert werden können, muss ein anderer Nachweis wie z. B. der [[BCA-Test]] – welcher gegenüber Detergenzien unempfindlich ist und wie auch der [[Lowry-Test]] eine kleinere [[Nachweisgrenze]] aufweist – verwendet werden. Weitere Alternativen sind [[UV/VIS-Spektroskopie|UV-Absorption]] (nur bei hohen Proteinkonzentrationen), [[Xanthoproteinreaktion]], [[Millon-Reaktion]], [[Ninhydrinreaktion]], [[Biuretreaktion]], [[Folin-Reagenz]] und eine [[Aminosäureanalyse]].

== Vorteile ==
* Schnell und preiswert
* Sehr sensitiv
* Farbstoff-Protein-Komplex ist für knapp eine Stunde stabil

== Nachteile ==
* Kalibrierung nötig
* Störanfällig gegenüber proteinchemischen Reagenzien
* Nichtlineare Standardkurve über einen großen Bereich
* Die Empfindlichkeit für verschiedene Proteine kann weit streuen, womit die Wahl des Standards wichtig wird. Die Methode ist für eine genaue Quantifizierung nur eingeschränkt brauchbar.

== Weblinks ==
* Serva: [https://www.serva.de//www_root/documents/39222_d_1.pdf Bradford] (PDF, deutsch; 125 kB)

== Einzelnachweise ==
<references />

[[Kategorie:Biochemische Nachweisreaktion]]
[[Kategorie:Protein-Methode]]

Bradford-Test - Versionsgeschichte

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