Quelltext der Seite Random Priming

Als '''Random priming''' (oder auch '''random-primed oligo-labeling''') wird in der [[Molekularbiologie]] eine Technik zur [[Molekülmarkierung|Markierung]] von [[Desoxyribonukleinsäure|DNA]] bezeichnet. Dabei synthetisiert man an [[Denaturierung (Biochemie)|denaturierte]] (einzelsträngige) DNA mit Hilfe von kurzen [[Primer]]n als Startpunkt einen markierten Gegenstrang.

Die Methode beruht auf den Arbeiten von Andrew P. Feinberg und [[Bert Vogelstein]] von der [[Johns Hopkins University]]. Mit über 21.000 im [[Web of Science]] annotierten Zitierungen gehört sie zu den meistzitierten Arbeiten in der Molekularbiologie. 

Zu Beginn wird die zu markierende DNA nach Zugabe eines Gemisches aus [[Oligonukleotid|Oligonukleotiden]], meist Hexaoligonukleotide mit zufälliger Sequenz, bei 95 °C denaturiert. Während des Abkühlens auf Raumtemperatur lagern sich passende Oligonukleotide an komplementäre Sequenzabschnitte der DNA an (''annealing''). Das als [[Klenow-Fragment]] bezeichnete Fragment der [[DNA-Polymerase|DNA-Polymerase I]] aus [[Escherichia coli|''E. coli'']] nutzt diese Primer, um den Gegenstrang bei 37 °C mit Hilfe markierter Nukleotide zu synthetisieren. Man benutzt das Klenow-Fragment, da dieses zwar von 5' nach 3' synthetisieren ([[Polymerase]]-Aktivität) und von 3' nach 5' Nukleotide herausschneiden kann ([[Exonuklease]]-Aktivität), jedoch nicht von 5' nach 3' schneidet. Das Klenow-Fragment fällt durchschnittlich nach 500 bis 2000 Basen von der Vorlage ab.

Die Markierung der DNA erfolgt wie bei der [[Nick translation]] dadurch, dass [[Radioaktivität|radioaktiv]] markierte (z.&nbsp;B. [α-<sup>32</sup>P][[Desoxyadenosintriphosphat|dATP]]) oder mit einem Markierungs-Molekül ([[Digoxygenin]], [[Biotin]], [[Fluoreszenzfarbstoff]]) verknüpfte [[Nukleotide]] eingesetzt werden. Durch die nur kurzen zu synthetisierenden Stränge ist dieses System sehr einfach und schnell. Vor der Anwendung werden die DNA-Moleküle, z. B. durch Größenausschluss-Chromatographie, von den nicht eingebauten Nukleotiden abgetrennt.

== Literatur ==
* A. P. Feinberg & [[Bert Vogelstein|B. Vogelstein]] (1983): ''A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity.'' In: ''[[Anal. Biochem.]]'' Bd. 132, S. 6–13. PMID 6312838

== Siehe auch ==
* [[Nick translation]]

[[Kategorie:Biochemisches Nachweisverfahren]]
[[Kategorie:Molekularbiologie]]
[[Kategorie:Nukleinsäure-Methode]]