Quelltext der Seite RNA-Extraktion

Die '''RNA-Extraktion''' umfasst biochemische Methoden zur [[Extraktion (Verfahrenstechnik)|Extraktion]] von [[RNA]] aus [[Zelle (Biologie)|Zellen]]. Die isolierte RNA kann in zahlreichen Methoden zur [[Genexpressionsanalyse|Analyse]] der [[Genexpression]] genutzt werden.<ref>L. V. Madabusi, G. J. Latham, B. F. Andruss: ''RNA extraction for arrays.'' In: ''Methods in enzymology.'' Band 411, 2006, S.&nbsp;1–14, {{DOI|10.1016/S0076-6879(06)11001-0}}, PMID 16939782.</ref> Die RNA-Extraktion ist eine der Methoden zur [[RNA-Reinigung]].

== RNasen ==
RNA ist im Vergleich zu DNA relativ empfindlich für abbauende Enzyme (bei RNA sind das [[RNase]]n), die ubiquitär vorkommen.<ref>S. C. Tan, B. C. Yiap: ''DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present.'' In: ''Journal of biomedicine & biotechnology.'' Band 2009, 2009, S.&nbsp;574398, {{DOI|10.1155/2009/574398}}, PMID 20011662, {{PMC|2789530}}.</ref><ref name="Chomczynski 2013">Piotr Chomczynski, William Wilfinger, Karol Mackey: ''Single-Step Method of Total RNA Isolation by Guanidine–Phenol Extraction''. In: ''eLS'' (2013). {{DOI|10.1002/9780470015902.a0003799.pub2}}.</ref> Zudem wird RNA in Zellen zügig abgebaut, weshalb Zellen zur späteren RNA-Extraktion bei −80 °C gelagert werden.<ref name="Chomczynski 2013" /> RNasen sind [[Enzym]]e, die RNA in kleinere Fragmente spalten. Sie katalysieren die Mg<sup>2+</sup>-unabhängige Hydrolyse von [[Phosphodiesterbindung]]en im Phosphatrückgrat der RNA. RNasen besitzen eine hohe [[Thermostabilität]] und können auch nach Autoklavierung noch aktiv sein. Deshalb erfordert der Umgang mit RNA mehr Sorgfalt als das Arbeiten mit der sehr viel stabileren DNA. Um RNA-Abbau zu vermeiden, sollten RNA und RNasen frühzeitig voneinander getrennt werden und verhindert werden, RNasen aus der Umgebung in die Probe einzubringen. Darum sollten Einweghandschuhe getragen werden, weil RNasen von allen Organismen produziert werden und daher auch im menschlichen Schweiß auf der Hautoberfläche und in Staubpartikeln vorhanden sind. Außerdem ist es sinnvoll, einen bestimmten Satz an Verbrauchsmaterialien (Pipetten, Pipettenboxen usw.) nur für RNA-Versuche zu verwenden. Zudem sollte spezielles RNase-freies Wasser verwendet werden ([[Diethylpyrocarbonat|DEPC]]-Wasser).

== Zellaufschluss ==
[[Datei:Arbeitsschritte.png|miniatur|Arbeitsschritte bei der RNA-Isolierung]]
Beim [[Zellaufschluss]] werden RNasen zügig [[Denaturierung (Biochemie)|denaturiert]],<ref name="Chomczynski 2013" /> meist durch [[Chaotrop]]e wie [[Guanidiniumthiocyanat]]. Oftmals wird dem Aufschlusspuffer zusätzlich ein Thiol wie z. B. 10 millimolar [[Mercaptoethanol]] oder [[Dithiothreitol]] hinzugefügt, um RNasen durch die Spaltung ihrer [[Disulfidbrücke]]n zu inaktivieren.<ref>K. Mommaerts, I. Sanchez, F. Betsou, W. Mathieson: ''Replacing β-mercaptoethanol in RNA extractions.'' In: ''Analytical biochemistry.'' Band 479, Juni 2015, S.&nbsp;51–53, {{DOI|10.1016/j.ab.2015.03.027}}, PMID 25841674.</ref><ref>S. E. Zale, A. M. Klibanov: ''Why does ribonuclease irreversibly inactivate at high temperatures?'' In: ''Biochemistry.'' Band 25, Nummer 19, September 1986, S.&nbsp;5432–5444, PMID 3778869.</ref> Anschließend wird die RNA von den übrigen zellulären Bestandteilen getrennt. Auf diese Weise erhält man Gesamt-RNA. Diese Gesamt-RNA lässt sich entweder direkt für weitere Experimente benutzen (z.&nbsp;B. [[Northern Blot]], [[Reverse Transkription]] in [[cDNA]]), oder sie kann als Ausgangssubstanz für die Isolierung von [[mRNA]] verwendet werden.

== Extraktionen ==
Die meisten RNA-Extraktionen basieren nach dem Zellaufschluss auf drei unterschiedlichen Verfahren, der Zwei-[[Phase (Materie)|Phasen]]-Extraktion,<ref name="Chomczynski 2013" /> oder der [[Fällung]], letztere eventuell mit zusätzlicher selektiver [[Adsorption]] an eine RNA-bindende Matrix.<ref>S. N. Peirson, J. N. Butler: ''RNA extraction from mammalian tissues.'' In: ''Methods in Molecular Biology.'' Band 362, 2007, S.&nbsp;315–327, {{DOI|10.1007/978-1-59745-257-1_22}}, PMID 17417019.</ref><ref>I. E. Jordon-Thaden, A. S. Chanderbali, M. A. Gitzendanner, D. E. Soltis: ''Modified CTAB and TRIzol protocols improve RNA extraction from chemically complex Embryophyta.'' In: ''Applications in plant sciences.'' Band 3, Nummer 5, Mai 2015, {{DOI|10.3732/apps.1400105}}, PMID 25995975, {{PMC|4435465}}.</ref> Die RNA-Extraktionsverfahren ähneln denen der [[DNA-Extraktion]]. Die Verfahren werden zum Teil auch miteinander kombiniert.<ref>I. M. Bird: ''Extraction of RNA from cells and tissue.'' In: ''Methods in molecular medicine.'' Band 108, 2005, S.&nbsp;139–148, PMID 16028681.</ref> Meistens folgt auf eine der Methoden eine abschließende Isopropanol- oder [[Ethanolfällung]].

=== Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Extraktion ===
Nach einem Zellaufschluss kann eine RNA-Extraktion mit einer Lösung aus [[Phenol]], [[Chloroform]] und [[Isoamylalkohol]] in einem Volumenverhältnis von 25:24:1 durchgeführt werden. Dabei bilden sich nach Zugabe zu den Zellen zwei Phasen, eine wässrige und eine organische Phase. Die RNA sammelt sich in der wässrigen Phase. Anschließend wird die wässrige Phase einer Isopropanol- oder Ethanolfällung der RNA unterzogen.

=== Trizol-Extraktion ===
[[Datei:PhOH-CHCl3 extraction.svg|mini|RNA-Extraktion durch Zwei-Phasen-Extraktion und Ethanolfällung.]]
Bei dieser Methode nach [[Piotr Chomczynski]] und [[Nicoletta Sacchi]] wird mit einem speziellen Reagenz (Handelsnamen und Varianten sind z.&nbsp;B. ''Trizol'', ''TRI Reagent'', ''Trisure'', ''TriFast'', ''STAT-60'', ''RNAzol'' oder ''DNAzol'') gearbeitet.<ref>P. Chomczynski, N. Sacchi: ''Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.'' In: ''[[Anal Biochem]].'' (1987) 162(1):156-9. PMID 2440339.</ref> Damit ist es möglich, Zellen zu lysieren und gleichzeitig RNA und DNA aus Zellen oder Geweben zu gewinnen. Dieses Verfahren basiert auf der sogenannten ''single-step''-Methode nach Chomczynski und Sacchi. Trizol enthält neben Phenol auch Guanidiniumthiocyanat, wodurch die Zellen lysiert und gleichzeitig RNasen und andere Enzyme inaktiviert werden. Wenn zu wenig Trizol im Verhältnis zur Probe verwendet wird, verschieben sich [[Ionenstärke]] und [[pH-Wert]], wodurch die Reinheit der isolierten RNA gesenkt wird.<ref name="Chomczynski 2013" /> Bei [[Blut]], [[Blutplasma]] und [[Zellkulturmedium]] können aufgrund ihrer höheren [[Puffer (Chemie)|Pufferwirkung]] Verschiebungen des pH-Werts auftreten.<ref name="Chomczynski 2013" />

Nach Zugabe von Chloroform zum Trizol sind drei Phasen zu erkennen. Die obere wässrige Phase enthält RNA, die Interphase DNA und die untere Chloroformphase Proteine. Die RNA in der wässrigen Phase wird anschließend mit Isopropanol oder Ethanol [[Ethanolfällung|präzipitiert]]. Nach zwei Waschschritten wird die RNA wird der Niederschlag getrocknet. Zu starkes Trocknen verhindert allerdings, dass die RNA vollständig in Lösung geht nach Zugabe von RNase-freiem Wasser ([[Diethylpyrocarbonat|DEPC]]-Wasser).<ref name="Chomczynski 2013" /> Aufgrund der Verwendung giftiger und flüchtiger Chemikalien ist eine Laborabzugshaube notwendig. Im Vergleich zur Festphasenadsorption ist die Zwei-Phasen-Extraktion kostengünstiger, aber sie dauert mit 4 Stunden länger.

=== „Nonidet P-40“-Methode ===
Diese Methode ist nicht für Gewebe geeignet und dient zur Gewinnung von mRNA aus dem Zytosol. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass die Zellkerne intakt bleiben und somit zusätzlich noch die Möglichkeit besteht DNA zu isolieren. Das Prinzip beruht auf dem nichtionischen Detergenz [[Nonidet P-40]] (synonym Triton-X100, Octoxinol 9), welches zu den Zellen gegeben wird und sich die DNA (Zellkerne) nach der Zentrifugation als Pellet absetzt. RNA, Proteine und Zelltrümmer bleiben in Lösung. Anschließend erfolgt wie bei der ''single-step''-Methode die Isolierung mit Phenol/Chloroform.

=== Adsorption an feste Phasen ===
Als weitere Möglichkeit der RNA-Isolierung stehen viele Kit-Systeme der [[Festphasenextraktion]] von verschiedenen Firmen und in zahlreichen Ausführungen zur Verfügung. Bei diesen Kit-Systemen verwendet man kleine Säulchen, die RNA spezifisch binden. Das [[Säulenbett]] bzw. die RNA-bindende Matrix besteht oftmals aus [[Kieselgel]]. Für die Reinigung von [[mRNA]] aus RNA können ''Oligo-dT-Säulen'' verwendet werden, die den [[Poly-A-Schwanz]] von mRNA binden.<ref>I. M. Bird: ''Extraction of RNA from cells and tissue.'' In: ''Methods in molecular medicine.'' Band 108, 2005, S.&nbsp;139–148, {{DOI|10.1385/1-59259-850-1:139}}, PMID 16028681.</ref>

=== Catrimox-14-Extraktion ===
RNA und DNA bilden mit manchen [[Kationisches Tensid|kationischen Tensiden]] unlösliche Komplexe.<ref>S. K. Dutta, A. S. Jones, M. Stacey: ''The separation of desoxypentosenucleic acids and pentosenucleic acids.'' In: ''[[Biochimica et Biophysica Acta]].'' Band 10, Nummer 4, April 1953, S.&nbsp;613–622, PMID 13059025.</ref> Bei der Catrimox-14-Extraktion werden die Zellen mit dem kationischen Tensid Catrimox-14 ([[Tetradecyltrimethylammoniumoxalat]]) und Guanidiniumthiocyanat lysiert. Nach einer Zentrifugation und einem Waschschritt erfolgt eine Extraktion mit Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol (25:24:1 Vol.). Die wässrige Phase wird anschließend einer Ethanolfällung unterzogen.<ref>C. E. Dahle, D. E. Macfarlane: ''Isolation of RNA from cells in culture using Catrimox-14 cationic surfactant.'' In: ''BioTechniques.'' Band 15, Nummer 6, Dezember 1993, S.&nbsp;1102–1105, PMID 8292344.</ref><ref>C. E. Dahle, D. E. Macfarlane: ''Isolating RNA with the cationic surfactant, Catrimox-14.'' In: ''Methods in Molecular Biology.'' Band 86, 1998, S.&nbsp;19–21, {{DOI|10.1385/0-89603-494-1:19}}, PMID 9664447.</ref> Analog erfolgt die [[CTAB]]-Methode zur RNA- oder [[DNA-Extraktion]],<ref name="DOI10.1007/BF02772128">Yolanda M. Camacho-Villasana, Neftali Ochoa-Alejo, Linda Walling, Elizabeth A. Bray: ''An improved method for isolating RNA from dehydrated and nondehydrated chili pepper (Capsicum annuum L.) plant tissues.'' In: ''Plant Molecular Biology Reporter.'' 20, 2002, S.&nbsp;407, {{DOI|10.1007/BF02772128}}.</ref> welche bei pflanzlichen Ausgangsmaterial eine höhere Reinheit und weniger RNA-Abbau aufweist als die Single-Step-Methode.<ref name="DOI10.3923/ajps.2008.505.509">K. Shahrokhabadi, R.T. Afshari, H. Alizade, J.T. Afshari, G.R. Javadi: [https://scialert.net/fulltext/?doi=ajps.2008.505.509 ''Compared Two Methods for Isolating RNA from Freezing and Nonfreezing Bread Wheat (Triticum aestivum L. ) Plant Tissues.''] In: ''Asian Journal of Plant Sciences.'' 7, 2008, S.&nbsp;505, {{DOI|10.3923/ajps.2008.505.509}}.</ref>

== Konzentrationsbestimmung per Photometrie ==
[[Datei:Optical density of ribosome sample.svg|mini|Spektrum von [[Ribosom]]en]]
{{Hauptartikel|DNA-Extraktion#Quantifizierung}}
Bei der [[Photometrie|photometrischen]] Konzentrationsbestimmung misst man die [[Extinktion (Optik)|Extinktion]] bei λ=260&nbsp;nm (auch Absorption, A<sub>260</sub>, Optische Dichte, OD<sub>260</sub>), dem lokalen Absorptionsmaximum von [[Nukleinsäuren]] (DNA, RNA), und bei λ=280&nbsp;nm (OD<sub>280</sub>), dem lokalen Absorptionsmaximum von [[Protein]]en. Ob die Probe mit genomischer DNA oder Proteinen verunreinigt ist, kann durch den Quotienten aus OD<sub>260</sub> und OD<sub>280</sub> ermittelt werden. Bei reiner RNA sollte das Verhältnis ungefähr bei 2,0 liegen. Liegt der Wert unterhalb ist die Probe mit Protein, genomischer DNA und/oder aromatischen Substanzen kontaminiert. In diesem Fall sollte die RNA erneut gereinigt werden.
Da eine OD<sub>260</sub> von 1 dabei 40&nbsp;µg/ml RNA entspricht, lässt sich die RNA-Konzentration mit folgender Formel berechnen:

Konzentration [µg/ml] = OD<sub>260</sub>&nbsp;×&nbsp;40&nbsp;µg/ml&nbsp;×&nbsp;Verdünnungsfaktor

== RNA-Integrität per Agarose-Gelelektrophorese ==
[[Datei:Gelelektrophorese.png|mini|RNA-Banden nach Gelelektrophorese<br />a: genomische DNA<br />b: 28S-rRNA<br />c: 18S-rRNA<br />d: 5S-rRNA]]
Mit Hilfe der [[Agarose-Gelelektrophorese]] können Nukleinsäuren ihrer Größe nach aufgetrennt werden, wobei kleine Fragmente schneller wandern als größere. Die Methode basiert auf den Wanderungseigenschaften der Nukleinsäuren, die durch ihre negativ geladenen Phosphatgruppen bei angelegter elektrischer Spannung in Richtung Anode (Pluspol) wandern. Dafür wird ein Agarosegel verwendet, das anschließend durch verschiedene Farbstoffe (z.&nbsp;B. [[Methylenblau]]) angefärbt werden kann. Dadurch kann die RNA sichtbar gemacht und fotografiert werden. Bei intakter RNA sind bei dieser Probe im Gel zwei deutlich getrennte Banden, die 28S- und 18S-Bande ribosomaler RNA zu erkennen. Das 2:1-Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten der 28S- und 18S-[[rRNA]]-Bande ist ein Zeichen dafür, dass die mRNA nicht abgebaut ist. Die 5S-Bande ist meist kaum oder gar nicht zu sehen.

== Geschichte ==
{{Hauptartikel|DNA-Extraktion#Geschichte|titel1=„Geschichte“ im Artikel DNA-Extraktion}}
Die Geschichte der RNA-Extraktion ist mit der Entwicklung der DNA-Extraktion verbunden, da beide chemische Eigenschaften der Nukleinsäuren aufweisen.

== Literatur ==
* C Wagener, O Müller: ''Molekulare Onkologie: Entstehung, Progression, klinische Aspekte''. 3., komplett aktualisierte und erw. Aufl. Thieme, Stuttgart [u.&nbsp;a.] 2009, ISBN 978-3-13-103513-4.
* [[Friedrich Lottspeich]], Haralabos Zorbas (Hrsg.): ''Bioanalytik.'' Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg u. a. 1998, ISBN 3-8274-0041-4.
* Cornel Mülhardt: Der Experimentator: Molekularbiologie/Genomics. Sechste Auflage. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2008, ISBN 3-8274-2036-9.
* [[Joseph Sambrook|J. Sambrook]], [[Thomas Maniatis|T. Maniatis]], D. W. Russel: ''Molecular cloning: a laboratory manual.'' 3rd edition (2001), [[Cold Spring Harbor Laboratory]] Press, ISBN 0-87969-577-3.

== Einzelnachweise ==
<references />

[[Kategorie:Molekularbiologie]]
[[Kategorie:Biochemisches Trennverfahren]]
[[Kategorie:Nukleinsäure-Methode]]