Quelltext der Seite Proteinreinigung

'''Proteinreinigung''' (auch '''Proteinaufreinigung''') bezeichnet den Vorgang, aus einem komplexen biologischen [[Gemisch]] oder einer [[Lösung (Chemie)|Lösung]], die mehrere [[Biomoleküle]] enthält, eines oder mehrere [[Protein]]e anzureichern und zu reinigen. Diese Anreicherung kann in mehreren, aufeinanderfolgenden Reinigungsschritten unter Anwendung unterschiedlicher Reinigungsmethoden verlaufen, deren [[Effektivität]] (die sinnvolle Aufeinanderfolge) und deren [[Wirkungsgrad|Effizienz]] (der Reinigungsgrad) mit analytischen Methoden verfolgt und quantifiziert wird. Meistens werden die Proteine per [[Überexpression]] mit einem [[Expressionsvektor]] erzeugt.

== Eigenschaften der Proteine ==
Proteine sind meist [[zwitterion]]ische [[Biopolymer]]e aus [[Aminosäuren]] mit einer [[molare Masse|molaren Masse]] zwischen einem und 350 [[Atomare Masseneinheit|Kilodalton]] ([[Proteinkomplex]]e nicht eingerechnet), wobei die meisten Proteine um die 20 bis 70&nbsp;Kilodalton liegen. Aufgrund der [[Proteinfaltung]] nehmen sie weniger Volumen ein als [[Nukleinsäuren]] oder [[Polysaccharide]]. Auch können [[Sekretion|sekretorische]] Proteine durch [[Disulfidbrücke]]n intramolekular [[Vernetzung (Chemie)|quervernetzt]] sein.

Durch die [[Peptidbindung]] absorbieren Proteine [[ultraviolettes Licht]] bei einer Wellenlänge von etwa 205&nbsp;nm (190&nbsp;nm bis 230&nbsp;nm), daneben absorbieren auch [[Phenylalanin]], [[Tyrosin]] und [[Tryptophan]] UV-Licht bei Wellenlängen von 280&nbsp;nm bis 288&nbsp;nm. Diese Absorption kann zur [[Photometrie|photometrischen]] Quantifizierung und zur Bestimmung der Reinigungsfaktoren verwendet werden. Im Gegensatz zu Kohlenhydraten und Nukleinsäuren kommen durch die verschiedenen enthaltenen Aminosäuren manche [[Strukturmotiv]]e nur bei Proteinen vor, z.&nbsp;B. [[Sulfhydryl]]-enthaltende [[Cystein]]e. Diese können für eine selektive [[Molekülmarkierung]] verwendet werden.

== Zellaufschluss ==
{{Hauptartikel|Zellaufschluss}}
Da aufzureinigende Proteine, meistens [[rekombinantes Protein|rekombinante]] Proteine, nach einem Zellaufschluss durch [[Virusinaktivierung|Inaktivierung]], [[Denaturierung (Biochemie)|Denaturierung]] oder [[Proteolyse]] gefährdet sind, wird eine Proteinreinigung oftmals zügig bei 4&nbsp;°C  durchgeführt. Wenn die [[biologische Aktivität]] des gesuchten Proteins erhalten bleiben soll, werden [[Puffer (Chemie)|Pufferlösungen]] mit physiologischem [[pH-Wert]] (meist sein [[pK-Wert]] ± 1) und isotonischer [[Ionenstärke]] (meist 50–100 [[Molarität|mM]]) verwendet. Als Puffer werden oftmals [[Good-Puffer]] oder [[TBS-Puffer]] verwendet. Je nach folgender Verwendung werden unterschiedliche Mengen an Protein benötigt (bis zu 100 mg bei einer [[Röntgenkristallstrukturanalyse]]). Bei größeren benötigten Mengen kann eine [[rekombinantes Protein|rekombinante]] [[Überexpression]] durchgeführt werden.

=== Zellfraktionierung ===
Gelegentlich erfolgt bei [[Eukaryoten|eukaryotischen]] Zellen nach dem Zellaufschluss und vor einer Proteinreinigung eine [[Zellfraktionierung]] durch [[differentielle Zentrifugation]], um [[zytosol]]ische Bestandteile und Zellkompartimente wie [[Zellkern]]e, [[Mitochondrien]] und [[Mikrosom]]en voneinander zu trennen.

=== Zusätze ===
Oftmals wird ein Zellaufschluss und eine Proteinreinigung in Anwesenheit von [[Proteaseinhibitoren]] durchgeführt. Einige Proteaseinhibitoren werden nur verwendet, sofern die Funktion des aufzureinigenden Proteins nicht gemindert wird oder ein Erhalt dessen Funktion unerheblich ist, da manche das Protein über eine [[kovalente Bindung]] dauerhaft modifizieren können. Sofern keine zweiwertigen Kationen wie [[Calcium|Ca<sup>2+</sup>]] oder [[Magnesium|Mg<sup>2+</sup>]] als [[Cofaktor (Biochemie)|Cofaktoren]] für die biologische Aktivität notwendig sind oder eine biologische Aktivität nicht erforderlich ist, werden [[Chelator]]en wie [[Ethylendiamintetraessigsäure|EDTA]] oder [[Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure|EGTA]] verwendet, wodurch im [[Lysat]] enthaltene [[Metalloprotease]]n gehemmt werden. Zur Vermeidung einer unerwünschten Ausbildung von Disulfidbrücken werden oftmals milde Reduktionsmittel zugesetzt, darunter Sulfhydryle wie [[Mercaptoethanol]], [[Dithiothreitol]] oder [[Dithioerythritol]] sowie [[Phosphane]] wie [[Tris(2-carboxyethyl)phosphin]], sofern keine [[Disulfidbrücke]]n für die biologische Aktivität notwendig sind oder eine biologische Aktivität nicht erforderlich ist. Zum Abbau von [[Nukleinsäuren]] wird gelegentlich die [[Nuklease A (Serratia marcescens)]] oder [[Benzonase]] verwendet, wodurch nebenbei die Viskosität des Lysats sinkt. Bei [[hydrophobizität|hydrophoben]] Proteinen wie [[Membranprotein]]e kann die Verwendung von [[Detergens|Detergenzien]] notwendig sein. Detergenzien lassen sich oftmals schlecht entfernen und stören [[Chromatographie|chromatographische]] Trennverfahren, weshalb sie meist in Konzentrationen unterhalb ihrer [[kritische Mizellbildungskonzentration|CMC]] eingesetzt werden, um keine zweite [[Phase (Materie)|Phase]] einzuführen. Proteinlösungen mit physiologischem pH-Wert sind anfällig für Bakterien- oder Pilzwachstum, weshalb für eine längerfristige Lagerung im flüssigen Zustand [[Biozid]]e wie 0,1 mM [[Natriumazid]], 0,005 % [[Merthiolat]] oder [[Ethanol]] zugesetzt werden. Natriumazid ist sehr giftig, inaktiviert [[Peroxidase]]n wie die [[Meerrettichperoxidase]] zur [[Immunfärbung]], reagiert mit eventuell notwendigen zweiwertigen Cofaktoren und bildet mit Metallionen in trockenem Zustand explosive [[Metallazide]].

== Trennprinzipien ==
Um Proteine zu trennen, nutzt man ihre durch die [[Proteinsequenz|Sequenz]] und spezifische [[Proteinstruktur|Struktur]] bedingten unterschiedlichen Merkmale aus. Meistens werden mehrere Methoden nacheinander durchgeführt, die Auswahl der Methode richtet sich dabei nach den Eigenschaften des Proteins, den jeweiligen Methoden-abhängigen störenden Begleitsubstanzen für anschließende Verfahren und einer eventuell einhergehenden Denaturierung. Höhere Reinigungsgrade (bzw. Reinigungsfaktoren) eines Verfahrens ermöglichen eine geringere Anzahl an Reinigungsschritten, z.&nbsp;B. bei der [[Tandem Affinity Purification]].

=== Isoelektrischer Punkt ===
Bei der Ionenaustauschchromatographie und der isoelektrischen Fokussierung erfolgt die Trennung anhand unterschiedlicher [[isoelektrischer Punkt]]e.

=== Molekülmasse ===
Bei der [[SDS-PAGE]] die [[Molekülmasse]] und [[posttranslationale Modifikation]]en, bei der Größenausschlusschromatographie und bei der Zentrifugation die Molekülmasse und [[Konformation]].

=== Dichte ===
Die [[isopyknische Zentrifugation]] separiert anhand der [[Dichte]].

=== Polarität ===
Die hydrophobe, die Umkehrphasen- und die polare Chromatographie trennen nach der [[Polarität (Chemie)|Polarität]] der verschiedenen exponierten polaren [[Aminosäuren]] und [[Posttranslationale Modifikation|posttranslationalen Modifikationen]].

=== Affinität ===
Die [[Affinitätschromatographie]] nutzt die Unterschiede in der [[Affinität (Biochemie)|Affinität]] zu einem selektiven [[Ligand]]en bzw. in den jeweiligen [[Dissoziationskonstante]]n.

=== Löslichkeit ===
Die Fällung mit [[kosmotrop]]en [[Salze]]n<ref name="Wen">J. Wen, S. Zhao, D. He, Y. Yang, Y. Li, S. Zhu: Preparation and characterization of egg yolk immunoglobulin Y specific to influenza B virus. In: ''[[Antiviral Res]].'' (2012) 93(1):154–159, PMID 22127067.</ref> aus der [[Hofmeister-Reihe]], wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln oder [[Temperatur]] beruht auf den veränderten [[Löslichkeit]]en. Die Extraktion mit einem Extraktionsmittel (meistens eine andere [[Phase (Materie)|Phase]]) oder [[Polyethylenglykol]]<ref name="Wen" /> basieren auf der Polarität und den unterschiedlichen Löslichkeiten in einem [[Lösungsmittel]] oder [[Detergens]], wie z.&nbsp;B. Mischungen von Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol (mit oder ohne [[Chaotrope Verbindung|Chaotrope]] wie [[Guanidiniumthiocyanat]])<ref>P. Chomczynski, N. Sacchi: Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. In: ''[[Anal Biochem]].'' (1987) 162(1):156–159, PMID 2440339.</ref> oder die Phasentrennung von einprozentigen (m / V) Lösungen von ''Triton&nbsp;X-114'' bei 4&nbsp;°C.<ref>H. Everberg, N. Gustavasson, F. Tjerned: ''Enrichment of membrane proteins by partitioning in detergent/polymer aqueous two-phase systems.'' In: ''Methods Mol Biol.'' (2008) 424:403–412, PMID 18369878.</ref><ref>P. O. Magalhães, A. M. Lopes, P. G. Mazzola, C. Rangel-Yagui, T. C. Penna, A. Pessoa Jr.: ''Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review.'' In: ''[[J Pharm Pharm Sci]].'' (2007) 10(3):388–404, PMID 17727802.</ref><ref>M. Wetterhall, G. Shevchenko, K. Artemenko, M. Ö. Sjödin, J. Bergquist: Analysis of membrane and hydrophilic proteins simultaneously derived from the mouse brain using cloud-point extraction. In: ''Anal Bioanal Chem.'' (2011) 400(9):2827–2836. PMID 21553125.</ref><ref>R. A. Mathias, Y. S. Chen, E. A. Kapp, D. W. Greening, S. Mathivanan, R. J. Simpson: ''Triton X-114 phase separation in the isolation and purification of mouse liver microsomal membrane proteins.'' In: ''Methods.'' (2011) 54(4):396–406, PMID 21272644.</ref>

== Trennverfahren ==

=== Chromatographie ===

* [[Ionenaustauschchromatographie]] (IEX)
* [[Größenausschlusschromatographie]] (SEC)
* [[Affinitätschromatographie]]
* [[HPLC|Polare Chromatographie]]
* [[Hydrophobe Interaktionschromatographie]] (HIC) und [[Reversed Phase|Umkehrphasen-Chromatographie]] (RPC)

=== Elektrophorese ===
* [[SDS-PAGE]]
* [[BAC-PAGE]]
* [[CTAB-PAGE]]
* [[Nativ-PAGE]]

=== Extraktion & Fällung ===
* Serielle [[Extraktion (Verfahrenstechnik)|Extraktionen]], z. B. [[DNA-Extraktion]], [[RNA-Extraktion]]
* Serielle [[Fällung]]en, z. B. [[Ammoniumsulfat-Fällung]], [[PEG-Fällung]], [[TCA-Fällung]], [[Ethanolfällung]], [[Hitzefällung]]

=== Filtration ===
* [[Dialyse]]
* [[Tangential-Flow-Filtration]]
* [[Mikrofiltration]]

=== Sedimentation ===
* [[Zentrifuge|Zentrifugation]]
* [[Pulldown-Assay]]s
* [[Magnetic Cell Separation|MACS]], ''{{lang|en|bead assays}}'' und [[Immunopräzipitation]] mit Hilfe von [[Antikörper]]n

=== Evaporation ===
* [[Lyophilisation]]

== Nachweisverfahren ==
Nach den einzelnen Etappen einer Proteinreinigung erfolgt eine [[Proteincharakterisierung]] und [[Quantifizierung]] der aufgereinigten Proteine. Die Effizienz der gesamten Reinigung wird durch die Bilanz bestimmt, wobei ein Reinigungsgrad (als Kehrwert des Massenanteils) aus der Proteinmasse, oder – bei [[Enzym]]en – auch ein Reinigungsgrad aus den [[Katalysatoraktivität|Enzymaktivitäten]] bestimmt werden kann, z.&nbsp;B. der Quotient aus der Gesamtmasse an aufgereinigtem Protein und der Ausgangsmasse des betrachteten Proteins im Ausgangsmaterial oder der analog gebildete Quotient mit den Aktivitäten.

== Literatur ==
* Friedrich Lottspeich, Haralabos Zorbas: ''Bioanalytik''. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 1998, ISBN 978-3827400413.
* Hubert Rehm, Thomas Letzel: ''Der Experimentator: Proteinbiochemie / Proteomics''. 6. Auflage, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2009, ISBN 978-3827423122.

== Einzelnachweise ==
<references />

[[Kategorie:Protein-Methode]]
[[Kategorie:Biochemisches Trennverfahren]]