Quelltext der Seite Hefe-Zwei-Hybrid-System

Beim '''Hefe-Zwei-Hybrid-System''' ({{enS|Yeast Two-Hybrid System}}, abgekürzt ''Y2H'') handelt es sich um eine [[Biochemie|biochemische]] Technik zur Aufklärung von [[Protein-Protein-Interaktion]]en.<ref name="fields">{{Literatur |Autor=S. Fields, O. Song |Titel=A novel genetic system to detect protein-protein interactions |Sammelwerk=Nature |Band=340 |Nummer=6230 |Datum=1989 |Seiten=245–246 |DOI=10.1038/340245a0 |PMID=2547163 |bibcode=1989Natur.340..245F}}</ref><ref name="hurt">{{Literatur |Autor=J. Hurt, S. Thibodeau, A. Hirsh, C. Pabo, J. Joung |Titel=Highly specific zinc finger proteins obtained by directed domain shuffling and cell-based selection |Sammelwerk=Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. |Band=100 |Nummer=21 |Datum=2003 |Seiten=12271–6 |DOI=10.1073/pnas.2135381100 |PMC=218748 |PMID=14527993 |bibcode=2003PNAS..10012271H}}</ref>

== Prinzip ==
[[Datei:Y2H.jpg|mini|Schema des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems. Das ''Bait''-[[Fusionsprotein]] bindet an die GAL4-Bindestelle vor einem Reportergen im [[Genom]] einer Hefezelle. Ein ''Prey''-Fusionsprotein muss nun in der Lage sein, an dieses ''Bait''-Fusionsprotein zu binden. Nur wenn eine solche Interaktion stattfindet (s. unten), resultiert daraus eine funktionelle Rekonstitution des GAL4-[[Transkriptionsfaktor]]s, was eine Expression des Reportergens zur Folge hat. Über dieses kann die Interaktion detektiert werden.]]

Das Hefe-Zwei-Hybrid-System ist eine ''[[In-vitro]]''-Methode zum Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen in [[Zuckerhefen|Hefe]], in der Regel der Bäckerhefe ''[[Backhefe|Saccharomyces cerevisiae]]''.<ref>V. Ratushny, E. Golemis: ''Resolving the network of cell signaling pathways using the evolving yeast two-hybrid system.'' In: ''BioTechniques.'' Band 44, Nummer 5, April 2008, {{ISSN|0736-6205}}, S.&nbsp;655–662, [[doi:10.2144/000112797]]. PMID 18474041, {{PMC|2526548}}.</ref> Grundlage hierfür ist ein zur [[Genregulation]] benötigtes [[Protein]], ein so genannter [[Transkriptionsfaktor]]. In ''Saccharomyces cerevisiae'' bedient man sich normalerweise des Transkriptionsfaktors ''GAL4''. Dieser besitzt zwei verschiedene [[Proteindomäne|Domänen]], eine zum Binden an der [[Desoxyribonukleinsäure|DNA]] (Bindedomäne, GAL4-BD) und eine, welche die [[Transkription (Biologie)|Transkription]] aktiviert (Aktivierungsdomäne, GAL4-AD). Obwohl die beiden Domänen sich normalerweise auf derselben [[Polypeptid]]kette befinden, sind diese auch dann wirksam, wenn sie von zwei unterschiedlichen Proteinen über nicht-kovalente Protein-Protein-Interaktionen zusammengebracht werden. Dazu bedient man sich zweier in Hefe kompatibler [[Vektor (Biologie)|Expressionsvektoren]].

Jedes der beiden Plasmide trägt jeweils ein für das entsprechende Experiment konstruiertes Fusionsgen. Dieses codiert im ersten Fall für ein [[Fusionsprotein|Hybridprotein]], das aus der GAL4-BD besteht und an der sich die Aminosäuresequenz anschließt, für die ein potentieller Bindungspartner gefunden werden soll (''Bait''-Protein, Köderprotein). Das zweite Plasmid codiert ein Hybridprotein, das sich aus der GAL4-AD und im Anschluss aus einem möglichen Bindepartner für das ''Bait''-Protein zusammensetzt (''Prey''-Protein, Beuteprotein). Beide Hefe-Zwei-Hybrid-[[Plasmid]]e replizieren sich sowohl in Hefe als auch in ''[[E. coli]]'' autonom ([[Shuttle-Plasmid|Shuttle-Vektoren]]).

Ein Hefestamm, der kein funktionierendes ''GAL4''-Gen hat und ein oder mehrere Reportergene trägt, wird mit beiden Plasmiden transformiert. Als Reporter dieser Interaktion fungieren [[Gen]]e, denen eine oder mehrere Bindestellen für den GAL4-Transkriptionsfaktor vorgeschaltet sind und die für Proteine codieren, die entweder bestimmte [[Aminosäure]]n bzw. Basen herstellen können (z.&nbsp;B. [[Histidin]], [[Uracil]] oder [[Adenin]]) oder eine optische Erkennung ermöglichen (z.&nbsp;B. ein Farbumschlag katalysiert durch das [[LacZ|lacZ-Gen]]). Wenn es zwischen ''Bait'' und ''Prey'' zu einer Interaktion kommt, resultiert daraus in der Regel eine funktionelle [[Rekonstitution]] des GAL4-Transkriptionsfaktors, was eine [[Genexpression|Expression]] der Reportergene zur Folge hat. Letzteres kann durch Wachstum auf entsprechenden Selektionsmedien nachgewiesen werden, z.&nbsp;B. auf einem Mangelmedium für Histidin wachsen in der Folge nur Hefen, bei welchen ''Bait'' und ''Prey'' interagieren und so das Enzym zur Histidin-Synthese exprimieren.

In einem [[Screening]]-Verfahren können in einem eher [[empirisch]]en Ansatz mit einer [[cDNA-Bank]] als „Prey“ mögliche Interaktionspartner identifiziert werden, oder aber es kann bei dem so genannten „Single mating“ mit diesem System gezielt die Interaktion für bestimmte Proteine überprüft werden. Die DNA-Sequenzen können aus einer [[DNA-Reinigung]] oder einer [[Künstliche Gensynthese#Chemische Synthese von Oligonukleotiden|Synthese]] stammen.<ref name="hurt" /> Es gibt Varianten des Y2H in ''E. coli'' und Säugetier-Zellen.<ref name="hurt" /><ref>B. Stynen, H. Tournu, J. Tavernier, P. Van Dijck: ''Diversity in genetic in vivo methods for protein-protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system.'' In: ''Microbiology and molecular biology reviews : MMBR.'' Band 76, Nummer 2, Juni 2012, {{ISSN|1098-5557}}, S.&nbsp;331–382, [[doi:10.1128/MMBR.05021-11]]. PMID 22688816, {{PMC|3372256}}.</ref>

== Vor- und Nachteile ==
Das Hefe-Zwei-Hybrid-System ermöglicht die Untersuchung von Protein-Protein-[[Interaktion]]en in zumindest ''in vivo''-ähnlichen Verhältnissen, d.&nbsp;h. im Milieu einer Zelle und mit in [[Eukaryoten]] vorkommenden posttranslationalen Modifikationen wie [[Glykosylierung]] (Anhängen von Zuckerketten), [[Palmitoylierung]] (Anhängen von [[Fettsäuren]]) oder Faltung durch [[Chaperon (Protein)|Chaperone]]. Da Hefe zudem relativ billig und robust zu handhaben ist, können viele Interaktionspartner, z.&nbsp;B. bei [[Screening]]-Ansätzen, überprüft werden.

Problematisch beim klassischen Hefe-Zwei-Hybrid-System ist aber, dass die Interaktion der zu untersuchenden Proteine im [[Zellkern]] der Hefe stattfinden muss, da die Transkription nur dort ablaufen kann. Es ist aber möglich, dass sich Proteine in diesem Milieu anders [[Proteinfaltung|falten]] als in dem Bereich der Zelle, in dem sie üblicherweise auftreten. Auch die Modifikationen der Hefe sind teilweise verschieden zu denen anderer eukaryotischer Organismen.
Diese veränderte Faltung beeinflusst [[Proteinstruktur|Struktur]] und Oberflächeneigenschaften der Proteine, wodurch es zu falschen Versuchsergebnissen kommen kann:
* Proteine, die normalerweise nicht miteinander interagieren würden, tun dies durch die veränderte Oberfläche (''falsch positiv'')
* Proteine, die tatsächlich miteinander interagieren, können dies durch die veränderte Faltung im Zellkern nicht (''falsch negativ'')

Des Weiteren ist es möglich, dass zwei Proteine zwar im Y2H-Versuch interagieren, aber im [[Zellzyklus]], im [[Zellorganell]] oder im [[Zelltyp]] nicht gleichzeitig auftreten und deshalb nicht tatsächliche Interaktionspartner sein können.

Aus den genannten Gründen muss die Interpretation von Y2H-Ergebnissen mit großer Vorsicht erfolgen. Positive Interaktionen müssen immer mit weiteren Techniken aus der Molekularbiologie verifiziert werden, wie beispielsweise [[Immunpräzipitation]] oder [[FRET]]. Das Y2H-Experiment gibt weiterhin zwar Auskunft über die mögliche Interaktion von zwei Proteinen, jedoch keine Informationen darüber, ''wie'' diese Interaktion stattfindet. Dazu sind detailliertere Untersuchungen der Struktur der beteiligten Proteine nötig.

Das klassische, hier beschriebene Hefe-Zwei-Hybrid-System besitzt noch weitere Einschränkungen. So lassen sich bestimmte Proteine nicht in den Zellkern transportieren, wie beispielsweise Membranproteine. Auch [[Proteinkomplex]]e, an denen mehr als zwei Proteine beteiligt sind, lassen sich mit klassischen Y2H-Experimenten nicht direkt untersuchen. Um diesen Problemen zu begegnen, wurden inzwischen modifizierte Hefe-Zwei-Hybrid-Systeme entwickelt, bei denen erst weitere Schritte die [[Rekonstitution]] des Transkriptionsfaktors ermöglichen. Auch gibt es inzwischen Systeme, die auf anderen Prinzipien beruhen, wie z.&nbsp;B. das [[Split-Ubiquitin System]], das besonders für Interaktionsstudien von Membranproteinen interessant ist.

== Einzelnachweise ==
<references />

[[Kategorie:Molekularbiologie]]
[[Kategorie:Nukleinsäure-Methode]]
[[Kategorie:Biochemisches Nachweisverfahren]]
[[Kategorie:Protein-Protein-Interaktionsbestimmung]]
[[Kategorie:Hefepilze]]