Quelltext der Seite Electrophoretic Mobility Shift Assay

[[Datei:Gel shift assay.png|mini|Spur 1 enthält als [[Negativkontrolle]] nur DNA, Spur 2 enthält DNA und ein nicht bindendes Protein, Spur 3 enthält DNA und ein bindendes Protein. Bei unvollständiger Bindung kann eine zusätzliche Bande ungebundener DNA auftreten.]]
Der '''Electrophoretic Mobility Shift Assay''' ('''EMSA''') oder '''Band Shift Assay''' ist eine [[Affinitätselektrophorese]] und dient zum Nachweis von [[DNA]]- oder [[RNA]]-bindenden [[Protein]]en, beispielsweise [[Transkriptionsfaktor]]en.<ref name=":0">{{Literatur |Autor=M. M. Garner, A. Revzin |Titel=A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system |Sammelwerk=Nucleic Acids Research |Band=9 |Nummer=13 |Datum=1981-07 |Seiten=3047–3060 |DOI=10.1093/nar/9.13.3047 |PMC=327330 |PMID=6269071}}</ref><ref name=":1">{{Literatur |Autor=M. Fried, D. M. Crothers |Titel=Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis |Sammelwerk=Nucleic Acids Research |Band=9 |Nummer=23 |Datum=1981-12 |Seiten=6505–6525 |DOI=10.1093/nar/9.23.6505 |PMC=327619 |PMID=6275366}}</ref>

== Eigenschaften ==
Zur Bestimmung von [[Protein-DNA-Interaktion]]en per EMSA werden Proteine mit einem DNA-Fragment bekannter Sequenz inkubiert, bei [[Protein-RNA-Interaktion]]en entsprechend mit einem RNA-Fragment. Bei der [[DNA-Sequenz]] handelt es sich meist um einen [[Genregulation#Genregulatorische Bereiche|regulatorischen Bereich]] eines [[Gen]]s (beispielsweise eines [[Promotor (Genetik)|Promotors]] oder [[Enhancer (Genetik)|Enhancers]]). Die Probe wird auf ein [[Agarose]]- oder [[Polyacrylamid-Gelelektrophorese|Polyacrylamid-Gel]] aufgetragen und mittels eines elektrischen Feldes werden die Komplexe aus Protein und DNA entsprechend ihrer Größe aufgetrennt.<ref name="CPIMB">{{Literatur |Autor=Frederick M. Ausubel |Titel=Current Protocols in molecular biology |Verlag=John Wiley & Sons |Ort=Chichester |Datum=1994 |ISBN=0-471-50337-1 |Seiten=12.2.1–11}}</ref> Im Vergleich zur reinen DNA-Bande tritt bei der [[Gelelektrophorese]] eine Laufweitenverschiebung (engl. ''{{lang|en|band shift}}'') auf, abhängig von Ladung, Konformation und Größe des Proteinligandenkomplexes. Enthält die Affinitätselektrophorese neben der DNA und einem interagierenden Protein noch einen [[Antikörper]] gegen das Protein, wird der Assay als ''{{lang|en|Supershift Assay}}'' bezeichnet. DNA-Protein-Antikörper-Komplexe wandern langsamer als DNA-Protein-Komplexe, welche langsamer als ungebundene DNA wandern. Nicht gebundene saure Proteine können in dem verwendeten Puffersystem im Gegensatz zu [[DNA-bindendes Protein|DNA- und RNA-bindenden Proteine]], welche oftmals eine positive Nettoladung aufweisen, ebenfalls in das Gel einlaufen. Da die Proteine aber nicht markiert sind, werden sie nicht ohne eine [[Proteinfärbung]] wie z. B. eine [[Silberfärbung]] sichtbar sein. Durch [[Verdünnungsreihe]]n lassen sich [[Affinität (Biochemie)|Affinitäten]] ermitteln.<ref>M. G. Fried: ''Measurement of protein-DNA interaction parameters by electrophoresis mobility shift assay.'' In: ''Electrophoresis.'' Band 10, 1989, S. 366–376. PMID 2670548.</ref> Die Komplexe dissoziieren nicht in der Elektrophorese durch einen Käfig-Effekt der Poren im Gel.<ref>M. G. Fried, G. Liu: ''Molecular sequestration stabilizes CAP-DNA complexes during polyacrylamide gel electrophoresis.'' In: ''Nucleic Acids Research.'' Band 22, Nr. 23, 1994, S. 5054–5059. [[doi:10.1093/nar/22.23.5054]]. PMID 7800499.</ref>

Durch Markierung der DNA können die Banden im Gel sichtbar gemacht werden, beispielsweise durch [[Molekülmarkierung]] mit einem [[Radionuklid]], per [[Digoxygenin]]-Markierung, per [[Biotinylierung]] oder mittels einer [[Fluoreszenzmarkierung]]. Hierbei dient zur Spezifizierung der Banden nicht nur die DNA und der Antikörper, sondern es kann auch nicht-markierte DNA in unterschiedlicher Menge zum Blockieren aber auch mutierte DNA zum Herausfiltern eines spezifischen Signals eingesetzt werden. Der Einsatz von Punktmutanten in der markierten DNA oder in dem unmarkierten Kompetitor erlaubt Rückschlüsse auf für die Bindung wichtige Nukleotide.<ref name="Kozelka2011">{{Literatur |Autor=Jiří Kozelka |Titel=Evaluation of dissociation constants from competition binding experiments based on the relative binding ratio |Sammelwerk=Analytical Biochemistry |Band=409 |Nummer=1 |Datum=2011 |ISSN=0003-2697 |Seiten=66–73 |DOI=10.1016/j.ab.2010.09.023}}</ref>

Der EMSA, der aufgrund seiner unkomplizierten Anwendung zu den gängigen Methoden bei der Aufklärung der Mechanismen der Genregulation gehört, basiert auf den Arbeiten von Garner und Revzin<ref name=":0" /> und von Fried und Crothers.<ref name=":1" />

Eine Abwandlung ist der Methylierungs- und Uracil-Interferenzassay, bei dem der Einfluss modifizierter Basen auf die DNA-Bindung untersucht wird. Er erlaubt Rückschlüsse auf Nukleotide, die in die Protein-DNA-Interaktion involviert sind.<ref name="BaldwinOettinger2001">{{Literatur |Autor=Albert S. Baldwin, Marjorie Oettinger, Kevin Struhl |Titel=Methylation and Uracil Interference Assays for Analysis of Protein-DNA Interactions |Sammelwerk=Current Protocols in Molecular Biology |Band=12 |Datum=2001 |DOI=10.1002/0471142727.mb1203s36}}</ref>

== Literatur ==
* Tom Moss (Hrsg.): ''DNA'Protein Interactions: Principles and Protocols (Methods in Molecular Biology).'' 2. Auflage. Humana press, 2001, ISBN 0-89603-671-5.

== Weblinks ==
* [http://protocolpedia.com/index.php?option=com_sobi2&sobi2Task=sobi2Details&sobi2Id=52&Itemid=81 Dr. Mirmira EMSA Protocol] (englisch)
* [http://protocolpedia.com/index.php?option=com_sobi2&sobi2Task=sobi2Details&sobi2Id=352&Itemid=81 Preparation of nuclear extract for EMSA] (englisch)
* [http://www.protocol-online.org/prot/Protocols/Gel-Mobility-Shift-Assay-for-transcription-factor-binding-2840.html EMSA for Transcription Factor Binding] (englisch)
* [http://www.activemotif.com/documents/1680.pdf Chemiluminescent Gel Shift Protocol] (englisch)

== Einzelnachweise ==
<references />

[[Kategorie:Elektrophorese]]
[[Kategorie:Molekularbiologie]]
[[Kategorie:Nukleinsäure-Methode]]
[[Kategorie:Biochemisches Nachweisverfahren]]